高压氧对脑卒中后大鼠神经功能的作用

马明明 王雪晶 李 玮 张杰文△

1）河南省人民医院 郑州 450003 2）郑州大学第一附属医院神经内科 郑州 450052

缺血性脑血管病是一类严重危害人类健康的常见病，具有发病率、病死率、致残率、复发率高的特点，给社会和家庭带来沉重的负担［1］。虽然超早期溶栓和急性期神经元保护取得重要进展，但对于大多数患者而言，脑卒中后瘫痪肢体的康复仍不理想。为探讨高压氧治疗对急性缺血性脑卒中后神经系统功能的影响，本研究选取SD大鼠成功建立线栓法大脑中动脉闭塞模型，在术后3h对HBO组大鼠开始高压氧治疗。梗死后5d、10d、14d以横木行走试验进行神经功能评分，同时进行TTC染色与梗死体积测量。观察高压氧对脑卒中大鼠神经功能恢复和梗死灶体积的影响，为进一步研究HBO治疗机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：SPF级SD大鼠48只，均为雄性，鼠龄3～4个月，体质量（315±20）g。实验动物均由郑州大学医学院实验动物中心提供，检疫后备用。

1.1.2 仪器和试剂：YC32190／0.3－22型高压氧舱系烟台冰轮高压氧舱有限公司生产，10%水合氯醛由河南省人民医院药剂科配置；4%多聚甲醛购自天津北联精细化学品有限公司。TTC（triphenyltetrazolium chloride，氯化三苯四唑）染色试剂购自北京中山生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组：将48只大鼠随机分成假手术组、模型组、HBO组，每组16只。①假手术组：仅分离颈总及颈外动脉，不插入尼龙线结扎大脑中动脉；②模型组：只造模，不做其他处理；③HBO组：造模后进行高压氧治疗。

1.2.2 模型制备：将模型组及 HBO组大鼠32只用线栓法［2］制成大脑中动脉梗死模型。在大鼠颈外动脉分叉处结扎颈外动脉，在近心端结扎颈总动脉，在颈总动脉近颈内、颈外动脉分叉处剪一小口，将尼龙线（直径0.188mm）顺势缓慢插入大脑中动脉，栓塞大脑中动脉起始端的血流，然后以尼龙线结扎颈总动脉。如大鼠苏醒后向右旋转或右侧肢体瘫痪则视为栓堵成功并入选实验。

1.2.3 高压氧处理：术后3h动物进舱，先用纯氧充分洗舱30min，新鲜钠石灰颗粒吸收CO2。按100kPa（1ATA）／min速率加压至0.25MPa，在高压下停留1h，后以0.25ATA／min速度匀速减压至常压并出舱活动，隔天1次，共暴露8次［2］。假手术组及模型组大鼠在同时段模拟进出舱活动。

1.2.4 大鼠肢体功能评分：在大脑中动脉梗死术后第5、10、14天对模型组及HBO组大鼠进行横木行走试验（beam walking test，BWT）评分法［3］，以判断肢体功能恢复的程度。

1.2.5 TTC染色和梗死灶体积测量：假手术组、模型组和HBO组术后24h与梗死后5d、10d、14d每组大鼠不同时间点处死，每个时间点每组大鼠取3只立即断头取脑，剥离血管和硬脑膜后，观察梗死灶外观。置于2%TTC溶液中，37℃避光恒温箱孵育30min，取出脑，放在－20℃冰箱10 min。待脑组织稍硬后，使用锋利刀片，由脑的前极向后极冠状切片，片厚约2mm，再置于2%TTC溶液中，37℃避光温育30min，然后转移至用PBS配置的4%多聚甲醛中固定。取最大层面，观察梗死灶面积，计算脑缺血梗死体积，并观察神经元损伤情况，计算其占据左半球的百分比。照片扫描后用Leica图像处理系统测定切片的脑梗死面积，利用既往公式［4］算出梗死区及缺血对侧脑片体积，利用梗死体积百分比（梗死体积／对侧脑片体积×100%）表示损伤程度。

1.3 统计学处理 全部数据应用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。采用方差分析和t检验，比较模型组、对照组和HBO组不同时间点大鼠肢体功能评分和梗死灶体积，以表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 术后大鼠肢体功能评分 按照平衡木试验评分，结果如表1所示。术后第5天模型组与HBO组评分差异无统计学意义（P＞0.05），模型组与 HBO组肢体功能恢复差异无统计学意义；术后第10、14天模型组与HBO组评分差异有统计学意义（P＜0.05），HBO组肢体功能恢复较模型组好。HBO组及模型组术后第10天评分较第5天评分差异有统计学意义（P＜0.05），第10天肢体功能较第5天有所改善；术后第14天评分较第10天评分差异有统计学意义（P＜0.05），第14天肢体功能均较第10天有所改善。见表1。

表1 2组脑梗死大鼠平衡木试验评分比较 （）

表1 2组脑梗死大鼠平衡木试验评分比较 （）

注：与 HBO 组相比，＊P＜0.05；与第5天相比，＃P＜0.05；与第10天相比，△P＜0.05

14d组别 肢体功能评分术后5d 术后10d 术后△＊△模型组 4.43±0.22 3.20±0.36＊＃ 2.80±0.14 HBO组 4.38±0.34 2.41±0.36＃ 2.05±0.31

表2 2组大鼠脑梗死体积比较 （）

表2 2组大鼠脑梗死体积比较 （）

注：与 HBO组相比，＊P＜0.05；与第5天相比，＃P＜0.05

14d组别 脑梗死体积／%术后5d 术后10d 术后＊模型组 36.58±4.49 29.85±3.64＊＃ 26.48±4.46 HBO组 39.54±5.95 23.47±4.36＃20.59±5.25

2.2 梗死灶体积 TTC染色显示大鼠左侧大脑出现梗死灶，梗死区域神经元大量死亡，染色较淡。梗死灶以额叶、顶叶、颞叶大脑皮质为主。用TTC染色分析的方法［4］对不同时期梗死体积进行测量。假手术组无梗死灶形成。如表3所示，模型组、高压氧组在脑梗死后无显著差异，从MCAO后24 h开始进行不同刺激，于不同时间点进行观测，结果发现，从第5天开始，高压氧组梗死体积均较模型组明显缩小（P＜0.05），此现象一直持续至第14天。不同时间点上看，随着时间延长，梗死灶体积逐渐减少，但第14天和第10天相比2组梗死灶体积差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

3 讨论

高压氧治疗急性缺血性脑卒中动物实验研究证实，HBO治疗急性缺血性脑卒中模型，特别是缺血再灌注模型疗效显著，而对于大血管永久性阻塞模型的疗效还有争议［5－6］。目前研究证实，高压氧治疗急性缺血性脑卒中的机制有多种：高压氧可通过改善缺血细胞代谢，清除氧自由基以及保护梗死周围缺血半暗带组织等改善脑梗死的预后［7－9］。但目前大多数临床观察还未充分证实急性脑梗死后高压氧治疗的有效性［10］。

本研究以线栓法成功制作大脑中动脉闭塞模型，术后3 h开始给予多次高压氧治疗，发现梗死后第10、14天高压氧组比模型组的神经功能恢复更加明显，证实早期开始高压氧治疗能够改善大脑中动脉永久闭塞大鼠神经功能，与Yin等［11］报道一致。用TTC染色方法，对不同时期梗死体积进行测量，结果发现从第5天开始，高压氧组梗死体积明显缩小（P＜0.05），此现象一直持续至第4周；从第5天开始2组梗死体积均较刺激前明显缩小，但第14天与第10天相比梗死灶体积仍然减小，差异无统计学意义（P＞0.05）。可能因为MCAO第5天大鼠的组织水肿较明显，由于高压氧的干预，可明显减轻组织水肿程度，从而明显减轻梗死灶体积。而在第14天，各组梗死灶体积和第10天已无明显差距，说明第2周梗死区域已发生软化坏死，梗死灶体积无显著改变。这提示我们，脑梗死后高压氧治疗要及早进行，从24h即开始干预可最大限度降低梗死面积，其机制在于此时梗死灶尚未开始软化，濒临坏死的神经元能够得到挽救，从而减少半暗带面积，限制脑梗死进一步发展。这可能与高压氧能够改善脑部缺氧、维持血脑屏障完整性、减少细胞凋亡和增加神经再生有关［12］。确切治疗机制有待于进一步研究。

综上所述，脑梗死早期开始高压氧治疗能够显著提高永久性闭塞脑梗死后大鼠神经功能评分，减小梗死灶体积，改善预后。脑梗死后给予高压氧治疗可能通过改善脑部缺氧、维持血脑屏障完整性、减少细胞凋亡和增加神经再生等促进脑梗死后的神经可塑性。此研究可能为临床上脑梗死患者尽早高压氧治疗提供理论依据。

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