7例散发性Creutzfeldt-Jakob病患者的PRNP和APOE基因突变/变异检测及其临床意义

罗 曼， 李骄星， 孙逊沙， 盛文利

Creutzfeldt-Jakob病简称CJD，其年发病率约为百万分之一，是以快速进展性痴呆为特征，伴有小脑、锥体系和锥体外系受损症状和体征的神经系统变性疾病。本病的发病类型可分为散发性、家族性、医源性和新变异型等4种形式，其中散发性CJD约占所有CJD的85%［1］。CJD是由一种特殊的具有感染性的蛋白质-朊蛋白(prion protein，PrP)所引起，而该蛋白由朊蛋白基因(prion protein gene，PRNP)编码。另外，载脂蛋白E(apolipoprotein E，APOE)基因的ε4等位基因已被广泛认可与阿尔茨海默病的发病有关，鉴于痴呆为CJD的主要临床表现，国外学者对白种人CJD患者进行了APOE基因检测，研究表明ε4等位基因可能也是CJD的危险因子［2］。本研究拟对中国汉族人群散发性CJD患者进行PRNP基因及APOE基因检测，了解其突变/变异对散发性CJD发病及表型的影响。

1 对象与方法

1．1 对象 包括7例散发性 CJD患者，为2010年8月～2011年8月中山大学第一附属医院神经内科患者。男性4例，女性3例。发病年龄为52～76岁，平均62．0±8．2岁。7例患者均进行了详细的内科及神经系统专科检查，并进行了脑电图、MRI、脑脊液14-3-3蛋白等辅助检查。诊断参照WHO提出的 CJD诊断标准［3］，排除脑血管病、炎症、肿瘤、外伤、代谢紊乱等疾病引起的痴呆，7例患者均诊断为很可能的(probable)CJD。全部患者无明确家族史，且均为中国汉族人群。

1．2 方法 抽取患者外周静脉血4ml，置EDTA抗凝管中。血样用血液基因组DNA提取试剂盒(北京TIANGEN公司)提取DNA，用核酸蛋白测定仪测定DNA纯度及浓度，二者均合格后保存于－20℃冰箱中备用。参照文献合成PRNP基因开放阅读 框 架 引 物［4］(F:5’-CAGAGCAGTCATTATGGCGAACCT-3’，R:5’-AGACCTTCCTCATCCCACTATCAG-3’)及 APOE 基因第四外显子引物［5］(F:5’-AACAACTGACCCCGGTGGCG-3’，R:5’-ATGGCGCTGAGGCCGCGCTC-3’)，引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。以基因组DNA为模板，应用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增基因片段。PCR反应体系为25μl，其中包括:DNA模板1μl，上、下游引物(20pmol/μl)各 0．25μl，10 × PCR buffer 2．5μl，dNTP(2．5mmol)2μl，Taq 酶(5U/μl)0．2μl，灭菌双蒸水 18．8μl。PCR 反应条件为:94℃ 预变性5min，94℃变性 30s，58℃ 或 65℃ 退火 30s，72℃ 延伸1min，共30个循环，最后72℃再延伸10min。PRNP基因退火温度为65℃，APOE基因为58℃。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，溴化乙锭染色。目的产物送广州赢森生物科技有限公司测序。

2 结果

2．1 PRNP基因测序 发现1例患者(病例1)存在PRNP基因E200K杂合突变(G598A)，经反向测序证实。结果(见图1)。病例1临床特点为:女性，58岁发病，亚急性起病，进展迅速。以记忆力减退及失语为首发症状，认知功能障碍进行性加重并逐渐出现小脑症状(头晕、行走不稳)、锥体外系症状(四肢不自主运动)、肌阵挛、缄默。病程2个月时出现意识障碍并逐渐加重。头部MRI示双侧扣带回、双侧丘脑等T1、T2长信号，脑干、小脑未见异常。脑电图示广泛性中波幅慢波，左侧颞区、额区间断性类周期性癫痫样放电，有时可波及到同侧其他导联。送广东省疾控中心检测脑脊液14-3-3蛋白(+)。发现6例患者PRNP基因M129V多态性(A385G)均为129基因型MM，仅1例患者(病例2)为129基因型MV，结果(见图2)。未发现国外报道［6］的可能与CJD致病相关的位点突变(G114V、R148H、D178N、V180I、T183A、H187R、T188K、E196K、V203I、R208H、V210I、E211Q、M232R、P238S)。

图1 病例1的PRNP基因测序结果示E200K杂合突变(G598A)

图2 PRNP基因M129V多态性测序结果

2．2 APOE基因测序 发现1例患者(病例3)存在 APOE基因 ε4等位基因，基因型为 E3/4(ε3ε4)，其余6例患者都未检测到该多态性，即基因型为E3/3(ε3ε3)。病例3临床特点为:男性，52岁发病，亚急性起病，进展迅速。以小脑症状(头晕、行走不稳)为首发症状，1w后出现进行性加重的认知功能障碍，并逐渐出现锥体外系症状(四肢不自主运动)、肌阵挛、缄默。病程1个月余即出现意识障碍并逐渐加重。头部MRI+DWI示双侧额颞顶皮层DWI不对称信号增强，脑皮层及小脑萎缩。脑电图示中重度异常，未见周期性放电。送广东省疾控中心检测脑脊液14-3-3蛋白(+)。

3 讨论

3．1 PRNP基因致病性突变检测 人类PRNP基因位于20号染色体短臂，共约20kb碱基。它包含2个外显子，第一外显子为非编码外显子，第二外显子含有795bp的开放阅读框架。现有研究表明，散发性CJD的临床病理及分子表型在很大程度上会受到PRNP基因变异的影响［7］。国外已报导的位于PRNP基因的CJD致病性突变包括:G114V、R148H、D178N、V180I、T183A、H187R、T188K、E196K、E200K、V203I、R208H、V210I、E211Q、M232R、P238S 等，本研究对7例散发性CJD患者进行了上述位点的检测，结果发现1例患者(病例1)存在PRNP基因E200K杂合突变(G598A)，未发现其他位点突变。

E200K是全球范围内PRNP基因的最常见突变，它是200位密码子由GAG突变为AAG，导致谷氨酸(Glu，E)改变为赖氨酸(Lys，K)。该突变最先在斯洛伐克乡村的CJD群集病例中发现［8］，几乎同时，利比亚的一个患病犹太家庭也被检测出了该突变［9］。目前，已有超过10个国家在CJD患者中发现了该突变，该突变的临床表型除了常具有严重的睡眠障碍外，总体来说与散发性CJD相似，而睡眠障碍可能与该突变常伴发显著的丘脑损伤有关。2010年，Gao等［10］报道了我国首例E200K突变的CJD患者，该例患者同样以睡眠障碍为典型临床表现，除此之外与散发性CJD无异。次年，中国疾病预防控制中心［11］对2006年～2010年中国克雅氏病监测网络获得的散发性CJD患者特点进行了总结，在所诊断的284例CJD患者中，仅发现1例E200K突变患者，即2010年Gao等所报道的病例。本研究所发现的该例E200K突变患者也具有与散发性CJD相似的特点，如发病年龄、进展性痴呆、小脑症状、锥体外系症状、肌阵挛、EEG及MRI改变、脑脊液14-3-3蛋白阳性等，这与以往报道相一致［6，10，12］，但其睡眠障碍并不明显，我们考虑有以下可能:(1)虽然该患者影像学检查也显示双侧丘脑损害，但可能在早期损害较轻，未显示明显的症状;(2)早期的智能障碍部分掩盖了睡眠障碍症状;(3)迅速出现的意识障碍掩盖了睡眠障碍症状。另外，虽然其家族成员均无CJD患者，但由于其出现了致病性突变，仍应归为家族性CJD，我们将联系其子女进行基因检测并追踪其家族成员的发病情况。

3．2 PRNP基因多态性检测 以往研究显示，PRNP基因M129V是与CJD易感性相关的多态性位点［6］。M129V(A385G)多态性是指 PRNP 基因第129位密码子可以为编码甲硫氨酸(Met，M)的ATG，也可以为编码缬氨酸(Val，V)的 GTG。在正常高加索人群中，37%的人群为 Met/Met(MM)，51%为 Met/Val(MV)，只 有 12%为 Val/Val(VV)［13］。多个研究均显示，该位点 MM 型与 CJD易感性相关，在散发性CJD患者中，MM型所占的比例可以达到70% ～80%［14，15］;在E200K突变所致的家族性 CJD中，MM型也显示与 E200K突变相关［6］。本研究所检测的7例CJD患者中共6例为MM型，所占比例高达85．7%。即使去除诊断为家族性CJD的病例1，剩余的6例患者中MM型所占比例亦达到83．3%，这与国外的报道一致，也与以往针对中国散发性CJD患者的研究结果一致［11］。

3．3 APOE基因多态性检测 人类APOE基因位于19号染色体长臂，由299个氨基酸组成，包含4个外显子和3个内含子。最常见的APOE多态性为ε2/ε3/ε4等位基因多态性，该多态性的分子学基础为氨基酸序列112位半胱氨酸(Cys)与158位精氨酸(Arg)互换。ε2在这两个位置均为Cys，ε4则均为Arg，ε3分别为Cys和Arg。这3种等位基因导致了人群中存在6种不同的基因型，即3种杂合子(E2/3、E3/4、E2/4)和3 种纯合子(E2/2、E3/3、E4/4)，其中ε3和E3/3是最常见的等位基因和基因型［16］，而 ε4等位基因已被广泛认可与痴呆有关。鉴于痴呆为CJD的主要临床表现，我们对CJD患者进行了APOE基因多态性检测，结果发现仅1例患者为E3/4(ε3ε4)基因型，其余6例均为E3/3基因型。该例E3/4基因型患者为所有患者中发病年龄最小(52岁)、疾病进展最快、症状较重的，有别于其他E3/3基因型患者。国外学者曾对CJD患者进行了APOE基因多态性及脑内β-淀粉样蛋白(Aβ)检测，结果发现ε4等位基因与脑内Aβ沉积相关，故得出ε4等位基因是加速CJD进展的危险因子的结论［2］。这可以帮助解释本研究中E3/4基因型患者发病早、进展快的现象。

本研究结合既往的研究结果表明，PRNP基因E200K突变为CJD致病性突变，129基因型MM多态性与散发性CJD易感性相关。本研究将1例E200K突变的家族性CJD患者误诊为散发性CJD患者，鉴于两者在临床表现的相似性，对CJD患者进行常规PRNP基因检测将有助于两者的鉴别，进而有助于对患病家系成员进行早期诊断。然而，由于本研究病例数较少，尚不能肯定APOE基因ε4等位基因对散发性CJD进展的影响确实存在，我们将在今后的工作中进一步加大样本量。

［1］Mead S，Stumpf MP，Whitfield J，et al．Balancing selection at the prion protein gene consistent with prehistoric kurulike epidemics［J］．Science，2003，300(5619):640 －643．

［2］Van Everbroeck B，Croes EA，Pals P，et al．Influence of the prion protein and the apolipoprotein E genotype on the Creutzfeldt-Jakob Disease phenotype［J］．Neurosci Lett，2001，313(1 ～2):69 －72．

［3］Zerr I，Kallenberg K，Summers DM，et al．Updated clinical diagnostic criteria for sporadic Creutzfeldt-Jakob disease［J］．Brain，2009，132(10):2659－2668．

［4］Yu SL，Jin L，Sy MS，et al．Polymorphisms of the PRNP gene in Chinese populations and the identification of a novel insertion mutation［J］．Eur J Hum Genet，2004，12(10):867 －870．

［5］Richard P，Thomas G，de Zulueta MP，et al．Common and rare genotypes of human apolipoprotein E determined by specific restriction profiles of polymerase chain reaction-amplified DNA［J］．Clin Chem，1994，40(1):24 －29．

［6］Brown K，Mastrianni JA．The Prion Diseases［J］．J Geriatr Psychiatry Neurol，2010，23(4):277 － 298．

［7］Imran M，Mahmood S．An overview of human prion diseases［J］．Virol J，2011，8(1):559 －567．

［8］Hainfellner JA，Parchi P，Kitamoto T，et al．A novel phenotype in familial Creutzfeldt-Jakob disease:prion protein gene E200K mutation coupled with valine at codon 129 and type 2 protease-resistant prion protein［J］．Ann Neurol，1999，45(6):812-816．

［9］Hsiao K，Meiner Z，Kahana E，et al．Mutation of the prion protein in Libyan Jews with Creutzfeldt-Jakob disease［J］．N Engl J Med，1991，324(16):1091－1097．

［10］Gao C，Shi Q，Zhou W，et al．The first Chinese case of Creutzfeldt-Jakob disease with mutation of E200K in PRNP［J］．Biomed Environ Sci，2010，23(2):158 － 160．

［11］Gao C，Shi Q，Tian C，et al．The epidemiological，clinical，and laboratory features of sporadic Creutzfeldt-Jakob disease patients in China:surveillance data from 2006 to 2010［J］．PLoS One，2011，6(8):e24231．

［12］Simon ES，Kahana E，Chapman J，et al．Creutzfeldt-Jakob disease profile in patients homozygous for the PRNP E200K mutation［J］．Ann Neurol，2000，47(2):257 －260．

［13］Owen F，Poulter M，Collinge J，et al．Codon 129 changes in the prion protein gene in Caucasians［J］．Am J Hum Genet，1990，46(6):1215－1216．

［14］Laplanche JL，Delasnerie-Laupretre N，Brandel JP，et al．Molecular genetics of prion diseases in France．French Research Group on Epidemiology of Human Spongiform Encephalopathies［J］．Neurology，1994，44(12):2347 －2351．

［15］Salvatore M，Genuardi M，Petraroli R，et al．Polymorphisms of the prion protein gene in Italian patients with Creutzfeldt-Jakob disease［J］．Hum Genet，1994，94(4):375 －379．

［16］Zannis VI，Breslow JL，Sangiacomo TR，et al．Characterization of the major apolipoproteins secreted by two human hepatoma cell lines［J］．Biochemistry，1981，20(25):7089 －7096．