苦豆籽中抑菌活性物质的跟踪筛选研究

史高峰，张 梅，陈学福，王国英，陈英赞

(兰州理工大学石油化工学院，甘肃兰州730050)

苦豆子(Sophora alopecuroides)是豆科槐属野生草本植物，广泛分布于我国西北的甘肃、宁夏、新疆等地，具有清热解毒、祛风燥湿、平喘止咳、止痛杀虫等作用［1－2］。现代药理研究表明，苦豆子生物碱具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗菌等药理活性［3－5］，尤其是在杀虫抑菌方面，具有很好的生物活性，已在农业上获得了广泛的应用。本文旨在筛选苦豆籽中有效成分的抑菌活性，对其抑菌作用进行系统的研究，并通过跟踪分离筛选出苦豆籽中最佳抑菌物质，为其在农业、医药和日用化学等行业中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验药物

苦豆籽(苦豆子的成熟种子)，产于宁夏盐池，粉碎，过60目筛保存待用。苦参碱、氧化苦参碱(本实验室自制，纯度＞90%);氧化苦参碱和氧化莱曼碱的混合物。

1.1.2 菌株

金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、大肠杆菌(C83)、绿脓杆菌(10104)、白色念珠菌(10231)由兰州大学基础医学院微生物学教研室提供。

1.1.3 培养基

水解酪蛋白琼脂、庆大霉素纸片(杭州微生物试剂厂);牛肉膏，蛋白胨、NaCl(杭州微生物试剂厂);蒸馏水等。

1.1.4 实验仪器

JH－DCB超净工作台、YLD－6000SHP恒温生化培养箱(扬州鸿都电子有限公司);RE－3000旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);SHZ－DⅢ循环水式多用真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司);YX280A手提式不锈钢蒸气消毒器(上海三申医疗器械有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 药品的制备

1.2.1.1 粗提物药液的制备 准确称取100 g粉碎的苦豆籽，置于1000 mL的圆底烧瓶中，采用质量分数为60%的乙醇溶液进行热回流提取，固液比为1∶6，提取时间为2 h，共提4次，过滤，合并滤液并减压浓缩，所得浓缩液取少量制成浸膏备用，剩余的浓缩液依次用石油醚、氯仿、正丁醇进行萃取，每种溶剂萃取至无色为止，所得萃取液分别浓缩，制得浸膏备用。

取60%乙醇浸膏、石油醚浸膏、氯仿浸膏、正丁醇浸膏溶于二甲基亚砜中，配制成浓度为300 mg/mL的药液，备用。

1.2.1.2 单体类药液的制备 取本实验室自制的苦参碱单体，氧化苦参碱单体及氧化苦参碱和氧化莱曼碱的混合物溶于无菌水中，配制成20 mg/mL的药液，备用。

1.2.2 菌液的制备

取实验菌种接种于MH琼脂平板培养基中，37℃培养20 h，用MH液体培养基制备菌悬液，菌液浓度为0.5麦氏单位(108cfu/mL)备用，5℃冰箱保存(不超过 12 h)［6］。

1.2.3 含药纸片的制备

将吸水性强的滤纸用打孔器打成直径为6 mm的圆形小纸片，分装于洁净干燥的小培养皿中，经121℃高压灭菌20～25 min后，取出，放入干燥箱内进行干燥，备用。每张滤纸片分别加药液各10 μL，空白对照组加无菌蒸馏水10 μL，阴性对照组加分析纯 DMSO 10 μL，阳性对照组加庆大霉素 10 μL［7］。

1.2.4 菌落记数

将实验的菌液稀释 10－5和10－6倍接种于 MH琼脂平板培养基中，37℃培养20 h，记数琼脂平板培养基菌株的个数。

1.2.5 最低抑菌浓度(MIC)的测定

将实验所用各种药液用适量的溶剂(DMSO)进行二倍稀释后，每张纸片分别加已稀释成不同浓度的药液10 μL，空白对照组加无菌蒸馏水10 μL，阴性对照组加分析纯DMSO 10 μL，置37℃恒温生化培养箱20 h，完全没有抑菌直径的最低浓度为该物质的最低抑菌浓度(MIC)。

1.2.6 K －B 实验法

取浓度为108cfu/mL的菌液100 μL，均匀涂布整块MH琼脂培养基表面，室温3～5 min后，贴加含药纸片，置入37℃恒温生化培养箱20 h，观察菌落生长情况，测定纸片周围抑菌圈直径大小，各稀释液的每项抑菌实验平行重复3次。

2 结果与讨论

2.1 苦豆籽粗提物的抑菌作用

取300 mg/mL的60%乙醇浸膏(A)、石油醚浸膏(B)、氯仿浸膏(C)、正丁醇浸膏(D)按照1.2.6方法进行实验。其对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的抑菌实验数据见表1。

表1 苦豆籽粗提物对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的抑菌作用

由表1可知，苦豆籽粗提物对实验所用菌种都有不同程度的抑制作用。对大肠杆菌的抑制作用为:C﹥D﹥A﹥B，即氯仿浸膏﹥正丁醇浸膏﹥60%乙醇浸膏﹥石油醚浸膏;对绿脓杆菌的抑制作用由大到小依次为:60%乙醇浸膏﹥氯仿浸膏﹥正丁醇浸膏﹥石油醚浸膏;对金黄色葡萄球菌的抑制作用由大到小依次为:氯仿浸膏﹥60%乙醇浸膏﹥正丁醇浸膏，石油醚浸膏的抑菌圈直径很小，无法测量，其抑菌作用非常微弱;对白色念珠菌的抑制作用由大到小依次为:氯仿浸膏﹥60%乙醇浸膏﹥正丁醇浸膏，石油醚浸膏抑菌作用微弱。

由上述实验结果可知:氯仿浸膏的抑菌作用是较强且广的，可能是因为氯仿浸膏中含大量生物碱，因此具有强抑菌作用。而石油醚浸膏中主要为低极性的脂溶性成分，因此抑菌作用较弱。

2.2 苦豆籽单体类化合物的抑菌作用

取20 mg/mL的苦参碱单体(E)，氧化苦参碱单体(F)及氧化苦参碱和氧化莱曼碱的混合物(G)按照1.2.6方法进行实验。其对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的抑菌实验数据见表2。

表2 苦豆籽单体对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的抑菌作用

由表2可知:苦豆籽单体类化合物对实验所用菌种都具有较强的抑制作用。对大肠杆菌的抑制作用:E﹥F﹥G，即苦参碱﹥氧化苦参碱﹥氧化苦参碱和氧化莱曼碱的混合物;对绿脓杆菌的抑制作用由大到小依次为:苦参碱和氧化苦参碱抑菌作用基本相当﹥氧化苦参碱和氧化莱曼碱的混合物;对金黄色葡萄球菌的抑制作用由大到小依次为:苦参碱﹥氧化苦参碱﹥氧化苦参碱和氧化莱曼碱的混合物;对白色念珠菌的抑制作用由大到小依次为:苦参碱﹥氧化苦参碱和氧化莱曼碱的混合物﹥氧化苦参碱。

由上述实验结果可知，苦参碱的抑菌作用是最强的，其次是氧化苦参碱，且对细菌的抑制作用要比真菌稍强，但对绿脓杆菌的抑制作用较弱。氧化莱曼碱对白色念珠菌的抑制作用较好，可进一步分离得到单体，进行药理活性研究。

2.3 苦参碱和氧化苦参碱的最低抑菌浓度(MIC)的测定

取5.0 mg/mL的苦参碱溶液和氧化苦参碱溶液作为原样液，采用二倍稀释方法按照1.2.6方法进行实验。其对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和白色念珠菌的最低抑菌浓度(MIC)实验数据见表3、表4。

由表3可知，最低抑菌浓度表明:V苦参碱对大肠杆菌的抑菌能力大于绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌。对大肠杆菌的最低抑菌浓度为19.55 μg/mL，对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的最低抑菌浓度为39.1 μg/mL。

表3 苦参碱对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的影响(MIC)

表4 氧化苦参碱对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的影响(MIC)

由表4可知，最低抑菌浓度表明:氧化苦参碱对大肠杆菌的抑菌能力大于绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌，对白色念珠菌抑菌能力最弱。对大肠杆菌的最低抑菌浓度为39.1 μg/mL，对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的最低抑菌浓度为78.2 μg/mL。

3 结论

本文通过对苦豆籽的不同极性部位药用成分及单体类化合物进行活性物质的跟踪抑菌实验，为进一步筛选天然抑菌剂的研究奠定了良好的基础，并得出以下结论:

苦豆籽不同极性溶剂萃取物对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌都有不同程度的抑制作用，其中氯仿浸膏的抑制作用较强，石油醚浸膏的抑制作用最弱;从苦豆籽中自制的苦参碱、氧化苦参碱以及氧化苦参碱和氧化莱曼碱的混合物对实验所用菌种也都有较强的抑制作用，其中苦参碱的抑制作用最强，并测定了苦参碱和氧化苦参碱对4种菌种的最低抑菌浓度(MIC)。可知苦豆籽中主要抑菌成分为生物碱类化合物，其中苦参碱的抑菌效果优于氧化苦参碱，因其独特的结构特征及化学性质广泛应用于农业、医药等行业，加强其活性研究具有重大的社会意义和经济效益，并为筛选有效的天然抑菌物质提供了实验依据。

［1］ 刘军锋，丁泽，欧阳艳，等.苦豆子生物碱抗茵活性的测定［J］.北京化工大学学报:自然科学版，2011，38(2):84－88.

［2］ 秦学功，元英进.苦豆子生物碱的研究与苦豆子综合利用［J］.中国野生植物资源，2000，19(4):30 －32.

［3］ 牟新利，王武宝，巴杭，等.中药苦豆子化学成分及生理活性的研究进展［J］.新疆师范大学学报:自然科学版，2005，24(1):45－50.

［4］ 周娅，杨志伟，赵建宁等.苦豆子总碱的体外抗菌活性研究［J］.宁夏医学院学报，2000，22(2):79 －81.

［5］ 李弟灶，潘显道，吴松.苦参碱类生物碱研究进展［J］.医学研究通讯，2005，34(1):65 －66.

［6］ 宋广运.忍冬不同器官绿原酸含量及体外抑菌效果［J］.中草药，1985，16(5):37.

［7］ 李新圃，张礼华，李宏胜.奶牛乳房炎主要致病菌的药敏试验［J］.中国兽医科技，1995，25(9):27 －28.