阿尔茨海默病生物标记物的研究进展

魏 艳 谢兆宏 许继平 毕建忠 (山东大学第二医院神经内科，山东 济南 250033)

阿尔茨海默病(AD)是一种慢性进行性神经系统变性疾病，是最常见的痴呆类型，其发病率逐年增加，在许多国家已成为主要的公共卫生问题。据统计，目前全球超过7 000万人有不同程度的痴呆，其中AD超过50%〔1〕。虽然近年来对AD的发病机理有了深入了解，但其确切的病因和发病机制仍不清楚。目前诊断仍以临床和神经心理学评估为基础，若要确认诊断，与其他原因的痴呆鉴别，正如美国神经病学及语言障碍和卒中研究所——AD及相关疾病深地(NINCDS-ADRDA)标准的要求，需要病理学或遗传学支持。然而，AD发病有较长的临床前期，可为治疗提供一个时间窗，以延缓或阻止病情进展，因此AD的早期治疗很重要，关键在于早期诊断。

早期生物标记物不仅可以提高诊断的准确性，还可监控AD的神经退变和疾病进展程度，评价治疗效果。在AD的研究过程中，生物标记物不仅可以补充最初传统的神经心理和影像等指标，还可能会提示抗痴呆药物的重要作用机理。因此，开发并研究AD的生物标记物具有重要的临床及现实意义。理想的AD生物标记物应当可以检测神经病理学的基本特点，其敏感性和特异性均应超过80%，还应具有可靠，可重复性好，无创，易实施等特点〔2〕。寻找AD的生物学指标应围绕其基本病理过程如老年斑(senile plaques，SP)的形成、细胞内神经纤维缠结(neurofibrillary tangles，NTFs)、氧化应激、炎症反应、脂质代谢异常、血管病变等进行。

1 β-淀粉样蛋白(Aβ)相关的生物学标记物

AD的典型病理变化之一老年斑是Aβ、早老素、载脂蛋白E(ApoE)等在细胞外组成的相对不可溶解的5～10 nm厚的淀粉样纤维，周围有萎缩的轴突、反应性星形胶质细胞和激活的小胶质细胞，其中Aβ是SP的主要成分。Aβ主要在神经元产生，来自于淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein，APP)溶蛋白性裂解的产物。可溶性的Aβ在血液和脑脊液中都有发现，这使得Aβ及其相关代谢产物有希望成为候选标记物。这些生物学标记物包括APP亚型、β－淀粉样前体蛋白裂解酶1(β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1，BACE1)、Aβ亚型、Aβ自身抗体和Aβ寡聚体等。

1.1 APP亚型 因外周循环的APP 95%以上存在于血小板中，故血小板中APP异构体蛋白的代谢变化受到广泛关注。大量研究表明〔3〕，血小板APP异构体在AD的发病过程中起重要作用，其降解产生的Aβ聚合体可以损伤突触和神经元。Zainaghi等〔4〕通过Western印迹方法来测定分析AD患者、轻度认知功能障碍(Mild cognitive impairment，MCI)患者和正常老年对照外周循环血中血小板APP130-和110-片段的含量比值(APP异构体比值)，发现与MCI和正常对照组相比，AD患者中此比值显著降低，而MCI与正常对照组之间却并无显著差异，由此提示APP作为AD候选标记物的可能性。但由于技术上的局限性及不易于大样本检测，与血浆中Aβ水平研究相比，该研究较少受人注重。

1.2 BACE1 BACE1启动Aβ的生成，成为AD主要的治疗靶点。越来越多的证据〔2〕显示，随着AD病情的发展，患者大脑BACE1水平也会随之升高。Devi等〔5〕通过比较BACE1敲除小鼠和AD转基因小鼠模型，发现敲除小鼠BACE1基因不仅可以在早期豁免记忆力下降，延缓海马中区胆碱能神经变性现象，还能显著降低 Aβ42和β-分泌酶水解产生的 C-末端(C99)。Mulder等〔6〕研究发现，BACE1在脑脊液中的活性与AD患者大脑病理变化相关。上述研究结果提示BACE1对AD的早期诊断是很有价值的。但是，目前的研究仅限于小样本，尚未见大样本、多中心的临床研究，因此，BACE1能否成为可靠的AD的生物学标记仍有待进一步研究。

1.3 Aβ亚型 Aβ并不是一个单分子，而是一系列含有不同氨基酸的分子肽家族，其中Aβ42和Aβ40是SP的主要成分，另外，在人体液中还至少可测得6种 Aβ亚型，包括 Aβ37，Aβ38，Aβ39，Aβ41 等〔7〕。目前为止研究较多的是脑脊液及血浆中Aβ42和Aβ40两种亚型。

1.3.1 脑脊液Aβ亚型 脑组织中Aβ的聚集和沉积是AD最主要的病理学特征，提供了Aβ亚型成为AD标记物的可能性。到目前为止〔2〕，已经报道了30多个有关脑脊液中Aβ42含量的分析研究。大多数结果表明，AD患者脑脊液中Aβ42的含量与正常对照组相比降低50%，在鉴别AD与正常对照的平均敏感性与特异性都高于85%，而且发现在精神疾病，如抑郁症，和其他一些神经疾病，如帕金森病(Parkinson's disease，PD)和核上性麻痹等，脑脊液中Aβ42均处于正常水平。然而，有1%的额颞叶痴呆和血管性痴呆中可以发现轻到中度降低，这提示了脑脊液Aβ42在AD与其他神经精神疾病方面鉴别的特异性，但单一应用Aβ42尚不足以应用于AD与其他神经退化机制的痴呆鉴别。因此，应该注重脑脊液Aβ42与其他标记物一起联合应用，尤其是Aβ42与tau蛋白联合，在AD早期有很高的敏感性、特异性和预测价值，可以用来当作AD临床前期的标记物。

与Aβ42相比，AD患者脑脊液中Aβ40的含量则不变或略有增加，但多数研究表明Aβ42/Aβ40比值降低，这种降低比Aβ42水平的降低更显著，此两项指标的联合应用对AD早期诊断更有意义。随着研究的深入，越来越多的Aβ亚型被发现。最近 Mulugeta〔8〕通过对 AD、路易体痴呆(dementia with Lewy bodies，DLB)、PD 和非痴呆对照组的研究发现，Aβ42/Aβ38 比值在鉴别 AD与 DLB方面最佳，敏感性达到78%，特异性67%。此项研究表明虽然单一的测量结果缺乏准确性，但脑脊液Aβ38与Aβ42联合应用有助于AD与DLB的鉴别诊断。这使得Aβ38成为潜在的AD生物标记物，其确切的应用价值还有待于进一步研究。

1.3.2 血浆Aβ亚型 虽然脑脊液是最理想的检测标本，但由于其样本采集的有创性而影响了其广泛应用，因而研究血液中AD的生物标志物就具有重要意义。新出现的证据〔9〕显示脑脊液和血浆中的Aβ通过受体介导的双向运输而达到一个动态平衡，血浆中Aβ含量在一定程度上可以反应Aβ的代谢程度。研究发现在家族性AD患者中，发病以前血浆Aβ水平表现为升高，随着病情的进展而渐下降。而最近的研究发现，Aβ40含量的升高及Aβ42含量的降低和痴呆的风险性之间是有关联的。在一项纵向研究中〔10〕，通过对AD门诊病人4年以上的随访，发现血浆Aβ40、Aβ42含量及超敏C-反应蛋白的变化与进展的认知功能障碍是相关的，表明血浆Aβ与其他潜在标记物联合应用可提高其敏感性和特异性。但也有研究表明，血浆Aβ浓度值在AD和正常人间重叠很多，在AD诊断上不具有充分的敏感度和特异性，但有可能作为评价AD发病危险性和发病前检查的方法。

随着对Aβ研究的深入，新型研究标本相继被发现。Bermejo-Pareja等〔11〕通过对AD、PD患者及正常对照的研究比较，通过超敏ELISA试剂盒测定其唾液和血浆中的Aβ水平，发现轻度AD患者唾液中虽然Aβ42含量的升高幅度很少，但仍有其统计学意义，而PD与正常对照之间此含量就没有差别。研究表明，唾液Aβ42有希望成为AD的外周标记物，有助于鉴别AD与其他神经退化性疾病，但确定其诊断意义尚需更多的研究结果来验证。

2 tau蛋白

tau蛋白是存在于神经轴突中的微管相关性蛋白，在人类大脑中有6种不同的亚型，存在多个磷酸化位点。1995年Arai等成功地用ELISA方法测定脑脊液中总tau蛋白(total tau protein，t-tau)含量，与对照组相比，AD与其他神经退化性疾病患者脑脊液中t-tau显著升高〔12〕。之后，许多学者都致力于研究t-tau与AD发病及病情进展之间的关系，探讨其作用机制。至今，有超过50项的研究证明，用ELISA方法测定的AD患者脑脊液中t-tau与对照组相比升高将近3倍，其敏感性和特异性均超过80%。虽然在发病早期就存在t-tau的升高，但t-tau升高水平与疾病进程无关〔13〕。而且，也有研究发现，在其他类型的痴呆，如血管性痴呆患者中，也发现t-tau含量升高。在一些神经退化性疾病，如PD、进行性核上麻痹和Pick病等，也偶尔会有t-tau含量升高。因而，在慢性神经变性疾病的研究中，常用脑脊液t-tau蛋白含量反映神经变性和损害的程度。

AD细胞内的NTFs主要由双螺旋纤维聚集而成，研究表明病理性的双螺旋纤维主要是由过度磷酸化tau蛋白(phosphorylated tau protein，p-tau)组成，患者脑中NTFs数量可以作为临床检测AD程度的一个重要指标，提示了p-tau作为AD生物标记物的可能性。脑脊液中p-tau的含量反应患者大脑t-tau磷酸化的水平。对于非特异性脑损伤如急性脑卒中，p-tau含量不如t-tau升高明显，而克-雅氏病(CJD)患者脑脊液t-tau水平虽有显著升高，但p-tau水平却没有变化〔14〕。这些发现表明脑脊液p-tau水平不像t-tau蛋白仅仅是神经损害的一个指标，最重要的是它反映了脑t-tau的磷酸化状态与AD患者NTFs的形成，在AD和其他疾病的鉴别诊断方面，p-tau有更高的灵敏度和特异性。不同位点磷酸化的tau蛋白在AD的鉴别诊断方面又各具特异性，如P-tau231在鉴别AD与额颞叶痴呆方面特异性较强，而p-tau181可用于AD与DLB的鉴别，在区分AD患者和血管性痴呆方面，p-tau199的特异性则比p-tau181更强〔15〕。

由于血浆中tau蛋白含量低于可测量的阈值，所以到目前为止，关于外周血液循环中tau蛋白含量的数据仍然很少，对于AD患者脑脊液tau水平的升高是否可能引起血液中tau水平的升高仍然不清楚，所以需要更多的研究来证实和扩展。

3 氧化应激标记物

随着年龄的增长，氧化应激损伤产生的代谢产物堆积，引发细胞损伤及神经元的凋亡，也是AD发病的重要危险因素。相关研究表明〔16〕，晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation endproducts，RAGE)是Aβ的特异性受体，通过与Aβ结合增强神经元氧化应激水平，使RAGE表达增多，尤其在Aβ聚集区。免疫组化研究〔17〕发现，AD患者大脑RAGEs明显高于正常人，而RAGEs也主要集中在NTFs中。上述研究提示，氧化应激学说在AD发病机制中处于重要地位，它与Aβ沉积学说、tau蛋白理论、炎性损伤学说等均紧密关联。氧化应激不仅是AD的早期事件，而且在AD进展的各期均表现显著。临床上定期监测外周血中特定氧化应激标志物的水平，及时应用抗氧化治疗，对于早期AD患者的认知功能可能有明显改善。

异构前列腺素(isoprostane)是自由基介导的多不饱和脂肪酸过氧化的产物，虽然它不具备神经毒性，但是在AD患者脑脊液中发现F2-异构前列腺素水平升高。在一项纵向研究过程中〔18〕，AD患者脑脊液F2-异构前列腺素水平显著升高，而在应用抗氧化药物后，其水平明显降低。但是，血浆中F2-异构前列腺素水平在AD与MCI患者之间没有明显差别，提示血浆中此物质作为标记物意义不大。关于血浆中F2-异构前列腺素能否作为标记物仍需要更多的研究来确认。

4 炎症反应标记物

目前为止，已有诸多研究〔13〕确认免疫炎性机制参与AD的发病进程，SP中Aβ的沉积与活化的小胶质细胞和星形胶质细胞表达炎性蛋白、神经调节因子如IL-6等有关。血浆炎症标志物，如白细胞介素(IL)-1、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α及急性时相蛋白如C-反应蛋白是血管性痴呆的标志物，在AD及血管性痴呆临床发病前增加。此外，Teunissen等〔19〕研究显示IL-12、IL-16、IL-18和TNF-β水平在轻度AD患者中较高，但在严重AD患者和非痴呆年龄相关配对组中无显著差异。

5 脂质代谢标记物

胆固醇代谢异常、脂蛋白a的不同亚型和水平变化、ApoE对胆固醇代谢的调节以及ApoE自身与Aβ的相互作用等已经被证实与AD的发生有密不可分的关系。ApoE蛋白是极低密度脂蛋白的主要成分，参与胆固醇通过血脑屏障的运输，其编码基因ApoEε4是目前为止唯一确认的散发AD的遗传学危险因素。与对照组相比〔9〕，ApoEε4等位基因在 AD与 MCI患者中表达率升高，其致病作用取决于它在胆固醇代谢中的作用。有纵向研究表明ApoEε2等位基因是AD的保护性因素，其作用可能与ApoEε4作用相反，而ApoEε3等位基因在AD的发生发展过程中起中性作用。

6 结语

近年来国内外对AD早期诊断的生物标记物进行了广泛研究，一致认为对于AD，发病机制复杂的疾病，联合应用多种不同代谢途径的标记物可以增强诊断的敏感性与特异性。脑脊液中 Aβ40，Aβ42，p-tau等生物学标记物，尤其是 Aβ42与tau蛋白的联合应用对于AD的早期诊断有一定的帮助。但是，脑脊液样本的采集是一种有创性技术，限制了其广泛应用，而血液样本的采集则具有无创、快速、方便等优点，但是到目前为止尚没有接近澳大利亚国家会计协会(NIA)标准的血浆标记物，尤其是在敏感性与特异性方面达不到要求。因此，研究血液中AD生物标记物则更具有现实应用意义。随着对AD发病机制的深入研究及相关技术的发展，开发高灵敏性和特异性的生物标记物将具有重要意义。

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