食品和饲料中镰刀菌毒素的检测方法

河南科技大学食品与生物工程学院 张勇法

河南科技大学医学技术与工程学院 杨建英 景爱华

镰刀菌毒素是镰刀菌产生的一类次生代谢产物，是影响谷物品质的一个重要因素。受镰刀菌毒素污染的食物进入动物体后，可抑制机体的免疫系统和生殖系统的功能。目前污染小麦的镰刀菌毒素主要包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）、伏马毒素（fumonisin）、单端孢霉烯醇（又称T-2毒素）和玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）。目前，我国对镰刀菌毒素的限量标准还不够完善，对伏马毒素和T-2毒素尚无限量。因此，建立快速准确的检测方法和制定完善的镰刀菌毒素的限量标准，对提高小麦籽粒的品质，保证食品安全具有重要意义。本文对镰刀菌毒素检测方法作一综述。

1 生物学检测法

Widestrand等（2003）利用镰刀菌毒素具有细胞毒性的性质，以5-溴-2'-脱氧尿苷（5-BrdU）生物鉴定来评估谷物提取液对3T3细胞DNA合成的影响，从而判断谷物镰刀菌毒素的含量。该方法较为简单，成本也低，适用于毒素检测的初步筛选，但其所需时间较长，专一性较差，不能确定一种或多种毒素的存在，也不能准确定量，因此该方法使用范围有限。

2 物理化学检测法

2.1 薄层层析法 薄层层析法 （thin layer chromatography，TLC）是毒素检测的经典方法，本方法具快速、设备简单、成本低、分离效果好等优点，但灵敏度稍差，并且对研究人员和环境有危害，而且TLC法涉及到一个可视化颜色定量的问题，还是不如气相色谱和液相色谱方便、准确（蒋木庚和杨红，1997）。近年来应用较少。

2.2 高效液相色谱法 高效液相色谱法（high performance liquid chromatography， HPLC）法通过色谱法对毒素含量进行测定，具有快速、准确、稳定、灵敏度高和自动化等优点，己成为一种极为普及的真菌毒素的检测手段。鲍蕾等（2005）采用免疫亲和柱净化、柱前衍生结合高效液相色谱法检测谷物中的T-2毒素，结果表明，方法的检测限为0.1 mg／kg，相对标准偏差低于9%，回收率为80.0%～95.0%。 Lippolis等（2008）研究发现，用I-NC、2-NC和PCC荧光标记HPLC法测定样品中的T-2毒素，其检测限分别为10.0、6.3 ng和2.0 ng。Danyi等（2009）利用HPLC法测定食品添加剂中ZEN及其衍生物，在样品前处理时比较了酶联免疫色谱净化与固相萃取净化两种方法对结果的影响，结果发现，前处理采用酶联免疫色谱净化法回收率为89%～110%，变异系数较小；而采用固相萃取净化法回收率较差，且待检物较易受到萃取柱载体的影响。林维宣等（2001）采用免疫亲和色谱法对样品进行前处理，使用邻苯二甲醛作为衍生化试剂测定了酱油中伏马毒素Bl、B2的含量，结果表明，回收率分别为84.6%～89.2%、60.3%～69.5%，最低检出限分别为0.01、0.02 mg/kg。最近几年，液相色谱与质谱联用技术以及荧光HPLC等的广泛应用使得HPLC检测的专一性显著提高（Meister，2008；Berthiller等，2005）。

2.3 气相色谱法 气相色谱法（gas chromatography，GC）法多用于毒素及其代谢产物的微量测定，是分析测定单端孢霉烯族毒素化合物的最理想方法，具有灵敏度高、高分离效能、高检测效能、分析快速等优点。但是，该方法前处理较繁琐，需要提纯净化。另外，气相色谱仪价格昂贵，推广应用具有一定的局限性。梁颖等（2006）在分析镰刀菌毒素的同时，还对其衍生化试剂及衍生条件进行了比较研究，结果发现，氟化衍生后检测灵敏度较高，而硅烷化衍生不需加热，在室温下即可完成，且生成物稳定。此外，ROMER公司推荐了乙腈-水（84:16，V/V）作为提取溶剂，该提取溶剂在目前镰刀菌毒素分析中使用比较广泛（Berthiller等 ，2005；Bily 等 ，2004；Eke等，2004）。目前，DON、T-2、ZEN和伏马毒素的免疫亲和柱均已商品化，被广泛应用于4种毒素的定量分析中（李军等，2006；隋凯等 2006）。

2.4 色谱-质谱联用法 质谱与气相色谱（gas chromatography-Mass spectrometry，GC-MS） 或液相色谱联用 （liquid chromatography-mass spectrometer，LC-MS），能增强鉴定的可靠性，具有专一性强，灵敏度高等优点。但由于只有专业测试或研究机构中心才具备其设备，而且存在前处理较为繁琐，需要对样品进行提取、净化和浓缩等应用瓶颈，所以并不适用于日常检测，普及具有一定困难。罗毅等（1998）建立的镰刀菌毒素的电子捕获GC-MS法，检测T-2毒素的最低限为5×10-11g。该法不仅能检测低含量的化合物，而且能确定混合物中的某一化合物，广泛应用于T-2毒素以及其他真菌毒素的检测，但是昂贵的设备限制了该法的广泛使用。Mateo等 （2002）建立了对DON、NIV、ZEN、T-2和伏马毒素 5种镰刀菌毒素的LC-MS检测法。刘承兰等（2005）采用LC-MS/MS法测定了玉米和芦笋中的伏马毒素B1、B2的含量，样品前处理采用固相萃取法净化，最低检测限为80 pg，回收率为78.3%～104.9%。

3 免疫学分析法

3.1 酶联免疫吸附法 曹艳红等（2006）采用直接竞争性ELISA法检测谷物中T-2毒素，结果表明，该方法最低检出量为0.125 ng/mL，添加70～280 ng/g T-2毒素的大米样品和面粉样品的平均回收率分别为85%～117.5%和98.1%～102.5%。竞争ELISA法是测定小分子抗原的方法，尤其适用于食品安全中镰刀菌毒素的检测（陈爱华和杨坚，2004）。Pal等（2004）建立免疫过滤膜法检测T-2毒素的方法，该免疫过滤膜上分布着36种抗体点区域，试验利用T-2毒素-辣根过氧化物酶（T-2 toxin-HRP）作为示踪分析物，以4-氯-1-萘酚作为底物，结果表明，该方法可以快速简便的检测出小麦和家禽饲料中的T-2毒素，检测敏感度分别为 12.5 mg/kg和 25 mg/kg。

3.2 放射免疫法 Ler等（2006）研究报道，利用放射性标记的三明治免疫学荧光化学发光和电化学发光检测法改进ELISA法，检测T-2毒素，可以提高检测敏感度。宋康泰等（1987）合成了T-2毒素的人工抗原T2-BSA和3H标记的T-2毒素，用T2-BSA免疫家兔获得的高质量的抗血清，与3H标记T-2毒素的亲和常数为3.2×109M-1，终滴度为l∶2000，测定水中T-2毒素的最低检出限为1.0 ng/mL，测定血和尿的样品时最低检出限为2.0 ng/mL。然而，由于放射免疫有一定的危险性，影响人身体健康，因此，该方法未被广泛应用。

3.3 免疫荧光法 荧光免疫分析（Fluoroimmunoassay）的方法很多，如荧光偏振免疫分析、荧光猝灭免疫分析、荧光增强免疫分析、时间分辨荧光免疫分析等。Lippolis等（2011）针对T-2毒素及其代谢物HT-2毒素建立了免疫荧光检测方法。免疫荧光法检测镰刀菌毒素，能够达到ng甚至pg的检测水平。

4 T-2毒素的其他检测法

由于以上方法只能检测一种T-2毒素，而T-2毒素的代谢物HT-2也常常存在于污染的谷物中，为了满足实际检测的需要，Visconti等（2005）建立了一种可以同时检测T-2和HT-2毒素的灵敏精确的新方法，即荧光标记的高效液相色谱法，免疫亲和净化后，1-antroylnitrile（1-AN）作为标记试剂，T-2毒素和其代谢物HT-2检出率分别为5 μg/kg和 3 μg/kg。 此外，Li等（2009）用桔林油脂酵母α-淀粉酶基因插入可以表达人体细胞色素P4503A4和同源的人CYP 450还原酶的啤酒酵母中。将该菌株和葡聚糖表达菌株用于微孔板真菌毒素生物学检测试验，用甲醇作溶剂，多粘菌素B九肽作为渗透促进剂；通过荧光检测糖酶的分泌受到抑制程度显示其毒性，可以检测T-2毒素的最低剂量为100 ng/mL。

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