瘤胃真菌体外培养条件对其产酶活性的影响

青岛农业大学动物科技学院 周光明 王利华

瘤胃真菌在粗饲料消化中起着非常重要的作用，但由于瘤胃真菌属于严格厌养菌，在工业生产中的应用受到一定的限制。因此，营造适合瘤胃真菌生长的环境，提高瘤胃真菌生长速度和产酶效率，将会对瘤胃真菌在秸秆处理、新型饲料及新酶源的开发等领域的广泛作用起到一定的推动作用。

1 环境因素

1.1 温度对瘤胃真菌的影响 微生物的生长和酶的合成均是在酶的催化下进行的，温度是保证酶活性第一要素，因此发酵过程中必须保证适宜的温度。Lowe等（1987）研究表明，厌氧真菌在36～41℃内均能较好生长，其最适温度为39℃，在此温度下产酶活力最高，生长速度最快，培养温度过高或过低酶活都会大幅度降低。

1.2 pH对瘤胃真菌的影响 在瘤胃中，pH通常保持在5.8～6.8，厌氧真菌在这一范围内能较好生长。 Barichievin和 Calza（1990）研究表明，培养基的pH对厌氧真菌有一定的影响，pH为6.0时酶活力最高。王照华（2004）研究发现，瘤胃真菌最适pH为6.5～7.0。

2 营养因素

2.1 碳源的影响 碳源作为瘤胃真菌的能量来源，对瘤胃真菌的生长和生产的影响尤为重要。朱崇淼等（2004）在研究瘤胃真菌A4菌发酵参数时发现，在分别以稻草秸、玉米秸、花生蔓、滤纸作为碳源时，A4菌均可产生具较高活力的木聚糖酶，其酶活分别为 14.3l、11.39、6.99 U/mL和 13.37 U/mL， 比活力分别为 26.96、15.95、22.29 U/mg 和25.12 U/mg；研究还发现，以稻草秸和滤纸为碳源时，二者培养液中羧甲基纤维素酶活力无显著差异（P>0.05），且均显著高于玉米秸组和花生秸组（P<0.05）。厉学武（2011）在以玉米秸、花生蔓、地瓜蔓及麸皮作为不同的发酵底物，筛选木聚糖酶和羧甲基纤维素酶体外培养的最优发酵条件时发现，以玉米秸秆为碳源时木聚糖酶活为最高，与其他三种碳源之间差异显著（P<0.05）；以地瓜蔓为碳源时，羧甲基纤维素酶活最高，与花生蔓之间差异显著（P<0.05）；以地瓜蔓为碳源时，木聚糖酶比活力和羧甲基纤维素酶比活力均为最高，与其他三种底物之间差异性极显著（P<0.01）。以上试验中，瘤胃真菌酶活差异较大，其原因可能是不同碳源诱导产生的差异。

2.2 硫源的影响 在瘤胃真菌合成含硫氨基酸的过程中为机体提供了硫源，但是瘤胃真菌利用不同的硫源的难易程度不同，而且含硫氨基酸在微生物合成的酶中又有重要的作用，所以硫源对瘤胃真菌的生长和酶活会产生重要的影响作用。郑拉弟 （2009）研究硫酸钠和硫化钠的不同水平（0.18%、0.25%、0.30%）对瘤胃真菌数量和瘤胃羧甲基纤维素酶活力的影响，结果表明，硫酸钠和硫化钠均能促进瘤胃真菌的生长；日粮干物质中硫含量为0.25%时，瘤胃真菌的平均数量显著增加；此外，研究还发现，硫酸钠和硫化钠均能显著提高瘤胃羧甲基纤维素酶活力，但是总的看来，硫酸钠的效果要优于硫化钠。

2.3 氮源的影响 氮源在氨基酸或者蛋白质的合成过程中起着重要的作用，因而也会影响瘤胃真菌的生长和其产酶的活性。

Dijkerman等 （1996） 报道， 厌氧真菌Piromyces E2菌在以胺盐为氮源时生长最好，以谷氨酸为氮源时也可生长，但以其他氨基酸、清蛋白、尿素、硝酸盐为氮源时，该菌的生长受到抑制。王海荣（2006）研究发现，不同氮源日粮对瘤胃真菌浓度和数量影响显著（P<0.05）；其中棉籽粕组显著高于鱼粉+麸皮组和豆粕组（P<0.05）；且瘤胃液相木聚糖酶活受氮源影响显著（P<0.05），其中鱼粉组极显著高于棉籽粕组和豆粕组 （P<0.01），棉籽粕组又显著高于豆粕组（P<0.05）。除较常规的饲料原料外，还有学者对酵母膏等不常用于饲料配合的原料做了相关研究。朱崇淼等（2004）研究表明，酵母膏浓度为 0、0.25、0.50 g/L的3个处理组所产生的木聚糖酶活及比活力均显著低于1.0 g/L组 （P<0.05）；酵母膏浓度为0、0.25 g/L组的羧甲基纤维素酶活及比活力均显著低于0.50 g/L和1.0 g/L组（P<0.05）。由此可见，较高浓度的酵母膏可促进木聚糖酶和羧甲基纤维素酶的产生。于红霞和王利华（2009）研究酵母膏的不同添加量（0%、5%、15%）对瘤胃真菌体外培养的影响，结果表明，酵母膏添加量对纤维素酶活影响显著（P<0.05），且纤维素酶活在24、48 h时最高；随酵母膏添加量增大，培养底物的粗蛋白质和真蛋白含量也明显增大，表明酵母膏对瘤胃真菌的生长有促进作用。

2.4 饲料中精料与粗料的影响 饲料的精粗比也会对瘤胃真菌的生长产生一定的影响，原因可能是由于精粗比会影响到瘤胃内的pH，从而影响瘤胃真菌的存活。也有可能是由于精料过多会加快瘤胃细菌的增殖，使得瘤胃细菌在瘤胃内占据了优势，从而影响了瘤胃真菌的生长；而过少时，瘤胃真菌又得不到充足的营养，生长也会受到限制。 孙云章等（2006）研究不同精粗比（0∶10、3∶7、5∶5、7∶3、10∶0）对瘤胃真菌和发酵特性的影响，结果表明，与0 h相比，发酵24 h时精粗比3∶7和5:5两组的瘤胃真菌数量均有较大幅度的增加，其中精粗比为3∶7时增加的幅度最大，为0 h的10倍，精粗比7∶3组和全粗料组的真菌数量明显减少，全精料组甚至检测不到真菌；发酵48 h时，全粗料组羧甲基纤维素酶活显著高于其他4组（P<0.05），且其他 4 组之间差异不显著（P>0.05）；木聚糖酶酶活则随底物精料比例的上升而显著下降（P<0.05）。由此可见，全粗料组的羧甲基纤维素酶和木聚糖酶酶活最高，说明纤维含量丰富的底物可诱导共培养系统中纤维降解酶的产生，但是有少量的精料则更有利于瘤胃真菌的增殖，所以要根据具体需要选择底物的精粗比，这样才可以得到更多的产品。

2.5 无细胞瘤胃液的影响 无细胞瘤胃液对瘤胃真菌产酶促进作用的机理尚不明确，原因可能是，瘤胃真菌在生长产酶过程中除了需要能量和蛋白质，还需要一定的无机盐甚至一些生长因子，而无细胞瘤胃液恰恰满足了瘤胃真菌这两大需求。朱崇淼等（2004）在产酶培养基中分别添加不同浓度（0、50、100、170 mL/L）的无细胞瘤胃液，进行发酵试验，结果表明，3个较低浓度组酶活及比活力均低于高浓度组，且3个较低浓度组之间无显著差异（P>0.05），说明培养基中无细胞瘤胃液必须处于较高浓度才能促进A4菌羧甲基纤维素酶的产生；此外，研究还发现无细胞瘤胃液浓度的高低对木聚糖酶活及比活力的影响均不显著（P>0.05），表明无细胞瘤胃液的浓度对木聚糖酶影响不大或无影响。

3 其他因素

3.1 饲料加工方式的影响 不同的饲料加工方式可能会改变饲料中纤维素和木质素的结合状态或者可为瘤胃真菌或其产生的酶提供更多的附着位点，而且有些加工方式还会改变精粗料之间的混合程度，从而影响瘤胃真菌的生长速度和其产生的酶的活性。Cann等（1993）研究发现，饲料经过氨化处理后有增加瘤胃厌氧真菌的趋势。Martin 等（1993）和 Williams等（1989）研究发现，瘤胃中纤维物质主要由与固体结合的瘤胃真菌释放的酶所消化。据此，陈小连（2007）测定了发酵底物上的纤维分解酶酶活，结果显示，饲料经过化学处理可以特异地提高纤维分解酶酶活，NaOH处理显著提高羧甲基纤维素酶和微晶纤维素酶酶活，而NH4HCO3处理对上述两种酶酶活影响不显著；与未处理组相比，NaOH和NH4HCO3这两种处理方法都能显著提高木聚糖酶活，并且木聚糖酶酶活随着培养时间延长有逐渐升高的趋势，且NaOH处理组效果更好。

化学处理会改变饲料的内部结构，改善饲料品质，从而更易于被瘤胃真菌利用。但有研究发现，仅仅简单的混合也会改善瘤胃真菌的营养条件。李德允（2006）分别对肥育期荷斯坦奶牛采用两种给料方式：全混日粮（TMR）和精粗料分离饲喂，结果发现，在第6小时和第9小时，TMR试验组的真菌数量显著高于精粗分离组（P<0.05）。

3.2 非离子型表面活性剂的影响 非离子型表面活性剂对瘤胃真菌的影响作用，可能是由于其能降低真菌表面的表面张力，促进相关酶或者有害物质的排除或者营养物质的吸收，从而加快瘤胃真菌的代谢速度引起的。Lee等（2003、1998）研究发现，添加0.05%的吐温80，能显著提高单中心真菌和多中心真菌的生长速度 （P<0.05）；然而，当添加量为0.10%时，单中心真菌的生长受到抑制，但多中心真菌的生长速度依然显著提高（P<0.05）。这说明低剂量的吐温80对瘤胃真菌有营养改善或促进代谢的作用，而高剂量的吐温80对瘤胃真菌的这种作用过强，甚至改变了单中心真菌的细胞内环境，从而表现出了一定的毒害作用；而多中心的真菌对这种作用有一定的耐受性，所以低浓度和高浓度的吐温80对其均表现出促进生长的作用。

4 小结

瘤胃真菌的体外发酵过程不仅受饲料加工方式、非离子型表面活性剂等因素影响，而且还受环境、营养等因素的影响，此外，目前还存在很多亟待解决的问题，如瘤胃真菌发酵产酶所需时间较长，发酵要求苛刻，发酵条件之间的组合优化等工作仍有待完善。

[1]陈小连.稻草与补充料组合影响瘤胃纤维消化和微生物生态的效应研究：[博士学位论文][D].杭州：浙江大学，2007.

[2]李德允.全混合日粮对肥育期的瘤胃发酵特性及其饲料消化率的影响[J].黑龙江畜牧兽医，2006，10：16 ～ 20.

[3]厉学武.瘤胃真菌体外主要发酵条件的筛选、应用效果及分子生物学鉴定：[博士学位论文][D].青岛：青岛农业大学，2001.

[4]孙云章，毛胜勇，姚文，等.不同精粗比底物下瘤胃真菌和纤维降解细菌共培养发酵特性及菌群变化[J].微生物学报.2006，46（3）：422 ～ 426.

[5]王海荣.不同日粮精粗比及氮源对绵羊瘤胃纤维降解菌群和纤维物质降解的影响：[博士学位论文][D].内蒙古：内蒙古农业大学，2006.

[6]王照华.S-Ⅱ型双外流连续培养系统与活体牛瘤胃发酵和厌氧真菌培养的比较研究：[硕士学位论文][D].内蒙古:内蒙古农业大学，2004.

[7]于红霞，王利华.酵母膏不同添加量对瘤胃真菌体外培养的影响[J].畜牧与兽医，2009，41（9）：54 ～ 56.

[8]郑拉弟.无机硫对绵羊瘤胃微生物数量及氮硫代谢的影响：[硕士学位论文][D].内蒙古：内蒙古农业大学，2009.

[9]朱崇淼，毛胜勇，孙云章，等.产木聚糖酶厌氧真菌菌株筛选及产酶培养条件研究[J].微生物学通报，2004，31（3）：11 ～ 15.

[10]Barichievin E M，Calza R E.Supernatant Protein and cellulase activities of the anaerobic ruminal fungus Neocallimastix ontalis EB 188[J].Applied and Envirnmental Microbiology，1990，56：43 ～ 48.

[11]Cann I K O，Kobayashi Y，Wakita M，et al.Effects of ammoniated rice straw feeding on microbes and their fermentation end-products in the rumen and caecum of sheep[J].Asian-Aust J Anim Sci，1993，6：67 ～ 72.

[12]Dijkerman R，OP den Camp H J M，Van der Drift C.Cultivation of anaerobic fungiin a 10-L fermenter system for the production of （hemi-）cellulolytic enrymes[J].APPlied Microbiology and Biotechnology，1996，46：85～91.

[13]Lee S S，Ahn B H，Kim H S，et a1.Effects of non-ionic surfactants on enzyme disttributionsofrumen contents，anaerobic growth ofrumen microbes，rumen fermentation characteristica and performances of lactating cows[J].Asian-Aust J Anim Sci，2003，16：104 ～ 115.

[14]Lee S S，Kim H D，Ha J K，et a1.Influences of surfactant Tween on the enzyme distributions，and growth of pure cultures of rumen non—and cellulotyic bacteria，and momo—and polycentric fungi[A].Proceedings of the 8th World Conference on Animal Production[C].SeouL，Korea：1998.356 ～ 357.

[15]Lowe S E，Theodorou M K，Trinci A P J.Growth and fermentation of an anaerobic rumen fungus on various carbon sources and effect of temperature on develoPment[J].Applied and Environmental Microbiology，1987，53：1210 ～1215.

[16]Martin C，Michalet—Doreau B，Fonty G，et al.Postprandial variations in the activity of polysaccharide-degrading enzymes of fluid-and particleassociated ruminal microbial populations[J].Curr Microbiol，1993，27：223 ～228.

[17]Williams A G，Withers S E，Strachan N H.Postprandial variations in the activity of polysaccharide-degrading enzymes in microbial populations from the digesta solids and liquor fractions of rumen contents[J].J Appl Bacteriol，1989，66：15 ～ 26.