LC－MS/MS在硝基呋喃类兽药残留检测中的应用概述

徐建飞 ，王 伟，杜晓宁

(上海化工研究院上海稳定同位素工程技术研究中心，上海 200062)

随着人民物质生活水平的提高，对食品安全的关注也越来越多。然而，目前食品安全却不容乐观，特别是动物源性食品安全问题，已成为一个全球性的议题，兽药残留是导致食品安全性下降的一个主要原因。根据联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)兽药残留联合立法委员会的定义［1］，兽药残留是指动物产品的任何可食部分所含兽药的母体化合物及其代谢物，以及与兽药有关的杂质。随着兽药和药物添加剂在畜禽饲养过程中的长期不合理使用，残留在动物体内的兽药，随着食物链进入人体，对人类的健康构成潜在威胁。因此，加强对兽药残留的检测，对保护生态环境和人类的身体健康有着极其重要的现实意义。硝基呋喃类药物是一类化学合成的广谱抗菌药物，广泛使用于敏感菌所致的泌尿系统感染治疗，是可能被非法使用的一类违禁兽药。近年来，质谱技术以其分析更趋简单、准确和快速的优点，在兽药残留的检测方面已得到广泛的应用。

1 硝基呋喃类兽药残留检测方法

目前，广泛使用的硝基呋喃类兽药残留检测方法主要有微生物学检测法、免疫分析法、仪器分析法、以及生物传感器、纳米材料、生物芯片等新技术［2］。

微生物学检测法是测定抗生素残留的经典方法，具有前处理简单、经济以及批量大等优点，但精确度、准确度和特异性不高，缺乏灵敏度;免疫分析法虽然具有较高的检测灵敏度，但此方法样品前处理较复杂，假阳性率高，很难实现现场检测，不能满足快速、无损伤的检测要求;生物传感器和纳米材料等新的检测技术还不够成熟，定量检测结果也不稳定。

仪器分析法主要指色谱与质谱联用技术(如GC－MS、LC－MS、GC－IR/MS)。液质联用技术因其灵敏快速、分辨率高、重现性好以及应用广泛等优点而被欧盟、中国及其他国家列为指定的兽药残留分析手段。液质联用技术同时利用了液相色谱较强的分离能力与质谱检测器丰富的结构信息，为目标化合物提供了可靠的定性和定量结果。由于目前主流的筛选方法的局限性，其检测阳性结果都必须通过明确的验证方法来进行定性和定量分析［3］，而质谱能够同时提供定性和定量信息，因此发达国家对于动物源性食品中的兽药残留检测均要求采用质谱法进行检测。

2 硝基呋喃类兽药残留检测现状

硝基呋喃类药物在动物体内代谢速度快、半衰期短，难以检出原药残留。出于安全性考虑，世界上绝大多数国家包括中国、欧盟、美国等规定在动物食用组织中不允许有硝基呋喃类药物的残留。如欧盟已于1995年禁止在食用动物中使用硝基呋喃类抗生素，并将其列为A类禁用药物(EEC/1442/95 和 EEC/2901/93)［4－5］，欧盟公报(2003/181/EC)［6］中规定所有家禽肉类和鱼类中的四种硝基呋喃类药物的最低残留量为1.0 μg/kg。我国也于2002年颁布了禁止使用硝基呋喃类兽药的禁令。

由于呋喃类药物能快速代谢而不易在食用动物组织中被检测到，通过测定母体化合物的方法检测硝基呋喃残留是不合适的［7］，但硝基呋喃在动物用药后所形成的蛋白结合代谢产物则可能在相当长的时间内留存在动物可食组织中［8－9］。目前，欧盟国家要求以代谢产物为目标分析物以达到检测硝基呋喃残留的目的。硝基呋喃类药物及其对应的代谢产物有呋喃唑酮(3－amino－2－oxaolidone，AOZ)、呋喃它酮(5－morpholino－3－amino－2－oxazolidone，AMOZ)、氨基脲(semicabazide，SEM)和氨基海因(1 － aminohydantoin，AHD)［10－11］。硝基呋喃代谢产物AOZ、AMOZ、SEM、AHD可在酸性条件下水解，同时可用2－硝基苯甲醛(2－nitrobenzaldehyde，NBA)衍生化，其相应衍生物分别是呋喃唑酮代谢物的2－硝基苯甲醛衍生物2－NPAOZ、呋喃它酮代谢物的2－硝基苯甲醛衍生物2－NP－AMOZ、呋喃西林代谢物的2－硝基苯甲醛衍生物2－NP－SEM、呋喃妥因代谢物的2－硝基苯甲醛衍生物2－NP－AHD，经提取和进一步净化后，残留量可用液相色谱－串联质谱(LC－MS/MS)进行检测［12－13］。

3 LC-MS/MS在硝基呋喃类兽药检测中的应用

林黎明等［14］提出采用乙酸乙酯提取，再用自行配制的液体净化试剂进行净化，可适用于各种动物组织的提取净化，方法简单、快速、廉价;采用LC－MS/MS多重反应监测，对4种代谢产物通过一级质谱分别选择其分子离子作为分母离子，与气体碰撞后，再经二级质谱分别选择两对子离子，进行定性定量测定;研究发现，对每一待测成分的两对监测离子进行组合后，可更有效地利用串联质谱的定性和定量信息，改善了信噪比，提高了定量检测的灵敏度。结果实际测定样品为FAPAS国际水平测试样品，样品基质为猪肾，其中含有1～4种硝基呋喃代谢产物，称取5.0 g样品2份，按上述分析方法进行操作，共检测出两种代谢物，分别为AMOZ和 AHD，含量分别为 1.9、0.76 μg/kg，添加回收率分别为68.2%和91.9%。

国内的丁涛等［15－17］使用了 LC －MS/MS测定蜂王浆和蜜蜂中 AOZ、AMOZ、SEM、AHD 4种硝基呋喃类药物代谢残留物的方法。以三氯乙酸作为蜂王浆的蛋白质沉淀剂，同时提供衍生化反应所需的酸性环境。实验结果表明，呋喃它酮代谢物的检测下限可以达到0.03 μg/kg，其他3种硝基呋喃类药物的代谢物的检测下限可以达到0.05 μg/kg，呋喃它酮代谢物的定量下限可以达到0.20 μg/kg，其他3种硝基呋喃类药物的代谢物的定量下限可以达到0.25 μg/kg，线性范围为0.4 ～20 ng/mL，添加回收率为97.7% ～104.8%(内标校正)，相对标准偏差(RSD)为 2.7% ～9.7%。

祝伟霞等［18－19］建立了动物性食品中呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因代谢物的测定方法，在酸性条件下水解，2－NBA进行衍生化，乙酸乙酯提取，固相萃取柱Oasis HLB富集净化，三级四极串联电喷雾质谱正离子模式测定，同位素内标定量。该方法灵敏度高、重现性好、定性准确可靠。通过对实际样品的检测，证明可用于动物源性食品中四种硝基呋喃代谢物残留的测定。

彭涛等［20－21］采用 LC －MS/MS同时测定奶粉中AOZ、AMOZ、SEM、AHD代谢物。盐酸水解奶粉中蛋白结合的代谢物，同时加入2－NBA，37℃过夜衍生化。加入硫酸锌，调pH值至7.0后，再加入亚铁氰化钾去除蛋白。后用乙酸乙酯提取，正己烷净化，分析物采用电喷雾电离正离子(ESI+)、多反应监测(MRM)模式检测，内标法定量。在添加浓度0.5 ～2 μg/kg 范围内，内标法回收率为 89.5% ～110.3%;相对标准偏差(RSD)小于 11.3%。AMOZ、AOZ 检出限为 0.05 μg/kg，SEM、AHD 为0.1 μg/kg。

赵善仓等［22］建立和发展了畜产品4种硝基呋喃类抗生素代谢物残留的LC－MS/MS快速检测方法，样品中与蛋白结合的代谢物经0.125 mol/L盐酸水解，2－NBA在37℃衍生16 h。上清液调节pH=7.4，用乙酸乙酯提取，正己烷净化，流动相定容。外标法定量，在添加浓度为 0.1～2.0 μg/kg范围内，4种代谢物的平均回收率在67.3% ～85.0%之间，10次测定结果的 RSD平均值在2.0% ～9.7% 之间。最低检出限均达到 0.15 μg/kg，在0.10 ～20.00 ng/mL 线性范围内，相关系数r均大于0.99，实现了样品检测的快速、高灵敏和高的选择性，适用于畜产品猪肉和猪肝中硝基呋喃类代谢物残留的检测。

随着硝基呋喃类兽药残留越来越引起人们的重视，国外一些专家和机构纷纷研究此类药物残留的检测方法，力求使最低检测限达到最低。如Conneely A等［23］采用LC－MS/MS测定了猪肝中呋喃唑酮代谢物AOZ的残留量。样品的净化过程采用过2次SPE柱的方法，其中的杂质和衍生化试剂干扰可以大大地降低。该方法在5.25 ng/g添加浓度下的回收率分别为(84±19.2)%和(90±16.3)%。2005年，他们进一步研究了4种NFs(硝基呋喃类药物)在猪体内的代谢机理，并建立了猪肉、猪肝和猪肾中4种硝基呋喃类代谢产物残留量的LC－MS/MS方法。他们通过给猪直接饲喂含四种硝基呋喃类添加剂的饲料，分别测定其药物原形和代谢产物。结果表明，动物组织中基本上未检出原形药物，而其代谢物的含量却非常高，4种药物的代谢物在猪体内非常稳定，停药6个星期后依然可以被检测出。

Leimer P等［24］建立了同时测定动物组织中4种硝基呋喃类代谢产物残留量的LC－MS/MS方法。样品经过聚苯乙烯SPE柱净化后，药物经水解与组织蛋白离解开，即与2－硝基苯甲醛发生衍生化，形成相对稳定的化合物。以2－硝基苯甲醛缩氨基脲为内标，在衍生化结束后加入样品中，以考察基质的离子抑制效应。使用ESI正离子模式进行监测时，检出限在0.5 ng/g，而定量限在2.5～10 ng/kg之间，其定性定量均可满足欧盟要求。

国外使用稳定同位素标记化合物作为内标物进行定量和定性的分析也在逐渐推广使用。如Effkemann等［25］采用稳定性同位素双标化合物［1，2－15N，13C］－SEM 作为内标物质，研究了测定动物组织和鸡蛋中呋喃西林代谢物的方法，方法检测限为10 μg/kg;Khong等［26］以稳定性同位素氘代化合物(d4－SEM等)为内标物质，建立了通过质谱方法测定蜂蜜中四种呋喃类兽药残留代谢物的方法，方法最终检测限范围在 0.12 ～0.56 μg/kg，定量限范围在0.07 ～0.46 μg/kg，检测误差可控制在18%以内;Becalski等［27］以稳定性同位素双标化合物13C，15N2－Semicarbazide作为内标物质，通过LC－MS/MS测定动物组织中呋喃西林代谢物的方法，方法检测限确定为 0.1 μg/kg;Mottier P 等［28］建立了基于同位素稀释技术的4种硝基呋喃类兽药残留检测方法。在酸性条件下把与蛋白结合的硝基呋喃类代谢物离解后，与2－NBA结合生成较为稳定的化合物。经液液萃取和固相萃取净化后，进行LC－ESI－MS/MS分析，方法对鸡肌肉中按欧盟的要求进行了验证试验，检出限在0.11～0.21 μg/kg，而定量限在0.19 ～0.36 μg/kg。

4 硝基呋喃类药物检测存在的问题及展望

目前动物性食品中硝基呋喃类药物检测存在着样品前处理繁琐，试剂用量大，检测仪器昂贵，阳性率高等问题。硝基呋喃类检测的研究重点是在不需要衍生化步骤的情况下，直接检测其代谢物来减少分析时间和成本。硝基呋喃类药物残留研究的另一方向是建立快速ELISA法，但目前商品化试剂盒只有单克隆抗体，若成功开发出4种呋喃类药物的抗体检测试剂盒，则能使硝基呋喃代谢物检测达到简便、快速、成本低廉、特异性强的目的。

［1］ 胡 滨，陈一资，朱雅冬.兽药残留对动物性食品的危害及原因分析［J］.中国动物检疫，2009，26(3)：21 －23.

［2］ 严 凤，黄士新，余 琛，等.液相色谱－质谱联用技术在检测食品中兽药残留的应用［J］.中国兽医寄生虫病，2007，15(2)：34 －40.

［3］ Forti A F，Campana G，Simonella A，et al.Determination of Chloramphenicol in Honey by Liquid Chromatography－Tandem Mass Spectrometry［J］.Analytica Chimica Acta，2005，529(1/2)：257－263.

［4］ The Commission of the European Communities.Commission Regulation(EC)No 1442/95 of 26 June 1995 amending Annexes I，II，III and IV of Council Regulation(EEC)No 2377/90 laying down a Community procedure for the establishment of maximum residue limits of veterinary medicinal products in foodstuffs of animal origin.Official Journal of the European Communities.1995，No.L143：26 －30.

［5］ Van Koten.Vemelen JEM.Report of the 40th Meeting of the JECFA World Health Organisation［C］.Geneva.1993.85：85 －90.

［6］ Commission Decision 2003/181/EC，March 13，2003，amending decision 2002/657/EC as regards the setting of minimum required performance limits(MRPLs)for certain residues in food of animal origin(2003).Official Journal of the European Union L71：17－18.

［7］ McCracken R J，Blanchflower W J，Rowan C，et al.Determination of furazolidone in porcine tissue using thermospray liquid chromatography－mass spectrometry and a study of the pharmacokinetics and stability of its residues［J］.Analyst，1995，120：2347 － 2351.

［8］ McCracken R J，Kennedy D G.Determination of the furazolidone metabolite，3 －amino－2 －oxazolidinone，in porcine tissues using liquid chromatography－thermospray mass spectrometry and the occurrence of residues in pigs produced in Northern Ireland［J］.J Chromat B，1997，691：87 －94.

［9］ Horne E A，Cadogan M，O’Keeffe，et al.Analysis of protein －bound metabolites of furazolidone and furaltadone in pig liver by high－performance liquid chromatography and liquid chromatography－mass spectrometry［J］.Analyst，1996，121：1463 －1468.

［10］ Lopez M I，Feldlaufer M F，Williams A D，et al.Determination and confirmation of nitrofuran residues in honey using LC－MS/MS［J］.J AgricFood Chem，2007，55：1103 －1108.

［11］ Wickramanayake P U，Tran T C，Hughes J G.Simultaneous separation of nitrofuran antibiotics and their metabolites by using micellar electrokinetic capillary chromatography［J］.Electrophoresis，2006，27：4069 －4077.

［12］ Gregory O Noonan，Timothy H Begley，Gregory W Diachenko.Semicarbazide Formation in Flour and Bread［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，56(6)：2064 －2067.

［13］ Effkemann S，Feldhussen F.Triple－quadrupole LC －MS－MS for Quantitative Determination of Nitrofuran Metabolites in Complex Food Matrixes［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2004，378(4)：842 －844.

［14］林黎明，林回春，高彦慧，等.液相色谱/串联质谱线性组合法测定动物组织中硝基呋喃代谢产物［J］.分析化学研究报告，2008，33(8)：1081 －1086.

［15］丁 涛，徐锦忠，沈崇钰，等.高效液相色谱－串联质谱联用测定蜂王浆中的四种硝基呋喃类药物的代谢物［J］.色谱，2006，24(5)：432 －435.

［16］蒋 原，丁 涛，徐锦忠.硝基呋哺类药物在克氏螯虾组织中消除规律的研究［J］.畜牧与兽医，2008，40(2)：34 －37.

［17］蒋 原，丁 涛，沈崇钰，等.液相色谱－电喷雾质谱联用检测蜂蜜中四种硝基呋喃类代谢物［J］.畜牧与兽医，2005，37(3)：12 －15.

［18］祝伟霞，杨冀州，魏 巍，等.高效液相色谱－串联质谱法测定动物性食品中硝基呋喃类代谢物残留［J］.现代畜牧兽医，2008，(1)：47 －50.

［19］祝伟霞，刘亚风，梁 炜.动物性食品中硝基呋喃类药物残留检测研究进展［J］.动物医学进展，2010，(2)：99 －102.

［20］彭 涛，储晓刚，杨 强，等.高效液相色谱/串联质谱法测定奶粉中的硝基呋喃代谢物［J］.分析化学，2005，33(8)：1073－1076.

［21］彭 涛，邱月明，李淑娟，等.高效液相色谱－串联质谱法测定动物肌肉中硝基呋喃类抗生素代谢物［J］.检验检疫科学，2003，(6)：23 －25.

［22］赵善仓，李增梅，刘 宾，等.超高效液相色谱串联质谱法测定畜产品中硝基呋喃类抗生素代谢物残留的研究［J］.中国兽药杂志，2008，42(7)：17 －21.

［23］ Conneely A，Nugent A，Keeffe M，et al.Isolation of bound residues of nitrofuran drugs from tissue by solid－phase extraction with determination by liquid chromatography with UV and tandem mass spectrometric detection［J］.Anal Chim Acta，2003，483：91 －98.

［24］ Leimer P，Zollner P，Lindner W.Determination of the metaholites of nitrofuran antibiotics in animal tissue by high－performance liquid chromatography － tandem mass spectrometry［J］.J Chromatogr A，2001，939：49 －58.

［25］ Effkemann S，Feldhussen F.Triple－quadrupole LC －MS－MS for Quantitative Determination of Nitrofuran Metabolites in Complex Food Matrixes［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2004，378(4)：842 －844.

［26］ Khong S P，Gremaud E，Richoz J，et al.Analysis of Matrix －Bound Nitrofuran Residues in Worldwide－Originated Honeys by Isotope Dilution High－Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry［J］.J Agric Food Chem，2004，52(17)：5309－5315.

［27］ Becalski A，Lau BPY，Lewis D，et al.Semicarbazide Formation in Azodicarbonamide － Treated Flour：A Model Study［J］.J Agric Food Chem，2004，52(18)：5730 －5734.

［28］ Mottier P，Khong S P，Gremaud E，et al.Quantitative determination of four nitrofuran metabolites in meat by isotope dilution liquid chromatography－electrospray ionisation tandem mass spectrometry［J］.J Chromatogr A，2005，1067：85 －91.