鸡球虫重组活载体疫苗研究进展

杜金粉，杨文涛，杨桂连，王春凤

(吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118)

鸡球虫病是由艾美耳属球虫引起的一种细胞内寄生虫病，严重影响养鸡业的健康发展。全球每年因鸡球虫病造成的经济损失难以估计，抗球虫药物研发和使用的费用数额巨大。目前，化学药物预防仍是养鸡业控制球虫病的一个主要方法，但化学药物的长期使用导致球虫产生耐药性、药物残留等一系列问题。应用传统疫苗如弱毒虫苗免疫预防球虫病虽然有一定效果，但存在毒力返强和散播病原的可能。因此通过基因工程方法制备基因工程新型疫苗预防鸡球虫病成为大势所趋，重组活载体疫苗是用基因工程技术将病毒或细菌构建成一个载体，把外源基因插入其中使之表达的活疫苗，其中以细菌或病毒为载体的基因重组活载体疫苗的研究倍受关注。本文对鸡球虫重组活载体疫苗的研究进行综述，旨在为鸡球虫免疫预防提供参考。

1 重组细菌活载体球虫疫苗

细菌载体具有培养方便，外源基因容纳量大，刺激细胞免疫力强等优点。同时起佐剂作用，刺激产生强的B细胞和T细胞免疫应答［1］。目前应用到球虫上的细菌活载体主要有沙门氏菌、卡介苗、乳酸菌、枯草杆菌等。

1.1 减毒沙门氏菌活载体疫苗 沙门氏菌属于革兰氏阴性杆菌、肠杆菌科。沙门氏菌的减毒是利用物理、化学或基因工程的方法，使某个或某些基因发生不可逆的突变，从而降低其毒力。减毒沙门氏菌作为一种活疫苗载体，既能保持持久的免疫刺激而不需要反复加强免疫，又能有效激发体液和细胞免疫［2］。目前减毒沙门氏菌被广泛应用于新型疫苗的研制且显示出广阔应用前景。Konjufca等将柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)抗原SO7基因在减毒鼠伤寒沙门氏菌进行了表达［3］。覃宗华等［4］构建了毒害艾美耳球虫(E.necatrix)MIC2基因、堆型艾美耳球虫(E.acervulina)cSZ1基因双基因共表达的重组减毒沙门氏菌，将重组减毒沙门氏菌经口免疫雏鸡后能诱导产生抗鸡球虫重组抗原的特异性IgG和IgA。免疫后3周试验鸡以同源 E.necatrix和E.acervulina攻击，可同时获得部分保护。杜爱芳等［5］将 E.tenella 5401 基因的真核表达质粒pcDNA3－5401，高压电转化到dam和phoP基因双突变的减毒鼠伤寒沙门菌中。将其口服接种于3日龄雏鸡，2周后用相同剂量加强免疫1次，二免后2周用E.tenella孢子化卵囊攻击。结果表明重组菌既能诱导产生抗E.tenella抗体，也能显著增强淋巴细胞增殖水平，其抗球虫指数(ACI)为164.98。

1.2 重组卡介苗活载体疫苗 卡介苗(BCG)是一种强免疫佐剂和非特异性免疫增强剂，并且热稳定性强、副作用小、易于生产，因此是表达重组外源基因的理想活菌疫苗载体。重组卡介苗(rBCG)是利用基因工程技术在BCG中导入外源基因，在rBCG中可表达病毒、细菌、寄生虫的抗原以及细胞因子等许多活性蛋白。Wang Q等［6］构建了含有E.tenella rhomboid基因的 rBCG pMV261－Rho和pMV361－Rho，分别将其免疫雏鸡后能诱导雏鸡产生较高水平的CD4+和CD8+，pMV261－Rho免疫组能诱导鸡产生抗E.tenella特异性抗体，56.04%的鸡能抵抗E.tenella孢子化卵囊的攻击，其抗体滴度与免疫后获得的保护率均高于pMV361－Rho免疫组。李运娜等［7］构建的鸡柔嫩艾美耳球虫ADF基因重组卡介苗pMV261－ADF和pMV361－ADF对柔嫩艾美耳球虫卵囊的攻击具有一定的免疫保护作用。苑淑贤等［8］构建堆型艾美耳球虫长春地方株pMV361－cszl重组质粒并在BCG诱导表达rBCG及检测免疫保护效果。

1.3 乳酸菌载体疫苗 乳酸菌是动物肠道内的常在菌，在动物体内长期存在，可以调节机体内环境的免疫状态，增强细胞免疫和体液免疫功能，从而发挥其抗感染的作用。乳酸菌具有诸多的益生功能，可控制肠道感染、抗肿瘤、促进小肠局部细胞免疫和体液免疫，产生黏膜分泌型IgA等。何高明等［9］研究了乳酸杆菌对雏鸡巨型艾美耳球虫(E.maxima)感染的影响，发现乳酸杆菌可减轻E.maxima对雏鸡肠道产生的损伤，说明乳酸菌本身对鸡球虫有很好的保护性效果。乳酸杆菌作为活疫苗抗原递呈载体具有很好的安全性，用其作为载体制备鸡球虫重组活载体疫苗可将乳酸菌的益生功能和保护性抗原的保护效果集于一身，具有广阔的应用前景。Yang等［10］将E.tenella SO7基因重组入大肠杆菌－乳酸菌穿梭表达载体，进而将重组菌免疫雏鸡后攻虫。结果显示与照组相比，免疫组雏鸡体重明显增加、发病率下降，盲肠病变计分显著降低。外周血中CD4+、CD8+T细胞的数量显著增加，表明该重组菌显著增强了鸡体细胞免疫水平。该重组菌对E.tenella具有很好的保护效果，为球虫乳酸菌重组活载体疫苗研究奠定了基础。徐镔蕊等［11］将E.tenella保护性抗原基因SO7导入乳酸杆菌表达载体并将重组菌免疫肉仔鸡。结果表明饲喂转基因乳酸菌组雏鸡受球虫攻击的组织病理学变化较轻，从而证明该重组乳酸菌对球虫感染具有一定的保护作用。王春凤等［12］将含有 E.tenella SO7基因的重组乳酸菌免疫雏鸡，发现该重组乳酸菌对攻虫后的雏鸡具有较好的增重效果，且可显著降低盲肠病变计分，显示了对鸡球虫很好的保护效果。张莉［13］将表达E.tenella TA4基因的重组乳球菌口服雏鸡十天，人工感染E.tenella一周后宰杀，通过增重、粪便中卵囊数、盲肠病变计分、盲肠卵囊数和抗球虫指数等指标进行评价。结果ACI为160.12，能较好保护球虫感染。

1.4 枯草芽孢杆菌载体疫苗 枯草杆菌广泛应用于工业发酵和微生物分子遗传学领域。该菌不产生毒素，是一种无致病性的安全微生物，具有完善的分泌系统，能将外源重组蛋白直接分泌至培养液中，大大减少了表达产物的分离纯化步骤，提高了回收率，现已应用于许多蛋白的表达［14］。黄现青等［15］研究了枯草芽孢杆菌fmbJ株产生的脂肽的抗球虫作用，研究表明感染不用药组、抗球虫药饮水组、灌胃和肌肉注射脂肽组对E.tenella的ACI分别为18.71、185.45、161.40 和 109.83。结果显示枯草芽孢杆菌fmbJ株产生的脂肽具有一定的抗球虫效果。Lee等［16］将芽孢杆菌饲喂雏鸡，攻虫后发现该类细菌可有效保护鸡体抗球虫感染，这为鸡球虫枯草芽孢杆菌活载体疫苗研究奠定了基础。

2 重组病毒活载体球虫疫苗

病毒活载体疫苗是疫苗研发的重要方向之一，因为它有免疫效力高、成本低及安全性好等优点。目前，主要的病毒活载体有牛痘病毒、禽痘病毒、金丝雀痘病毒、人2型和5型腺病毒、火鸡疱疹病毒、伪狂犬病病毒、水痘－带状疱疹病毒、微RNA病毒、黄病毒和脊髓灰质炎病毒等。Yang等［17］构建了含有E.tenella rhomboid基因的重组鸡痘病毒rFPV－rhomboid，将其免疫3日龄雏鸡，结果免疫组无论从卵囊记数、盲肠病变记分，还是相对增重、抗体产生以及细胞免疫水平均优于空白对照组。当分别用102、104和106PFU不同的剂量免疫雏鸡，E.tenella孢子化卵囊攻虫，其保护率分别为39.6%、41.1%和41.7%。有关重组病毒活载体疫苗的研究相对较少，还有待进一步研究。

3 结语

总之，近年来鸡球虫基因工程疫苗发展迅速，其中是以细菌和病毒为载体的重组活载体疫苗研究非常活跃，此种疫苗的研究为鸡球虫病免疫预防提供了新途径。但这些疫苗尚处在试验研究阶段，还有一些瓶颈技术有待解决，例如载体的优化，球虫保护性抗原基因的筛选等。但随着分子生物学和基因工程技术的发展和球虫免疫学研究的不断深入，以上问题都会逐步得到解决。

［1］张 波，陈冠军.细菌载体疫苗的研究进展［J］.微生物学免疫学进展，2002，30(2):86 －90.

［2］徐引弟，郭爱珍，陈焕春.减毒沙门氏菌载体的研究进展［J］.畜牧兽医科技信息，2007，12:4 －5.

［3］Konjufca V，Jenkins M，Wang S，et al.Immunogenicity of recombinant attenuated Salmonella enterica serovar typhimurium vaccine strains carrying a gene that encodes Eimeria tenella antigen SO7［J］.Infect Immun，2008，76(12):5745 －5753.

［4］覃宗华，谢明权，蔡建平，等.堆型艾美耳球虫cSZ1基因在减毒沙门氏菌的表达及免疫保护效果研究［J］.寄生虫与医学昆虫学报，2005，12(1):6 －13.

［5］杜爱芳，工素华，胡松华，等.减毒沙门氏菌为载体传递鸡球虫疫苗的安安全性、稳定性与免疫原性［J］.中国兽医学报，2006，26(2):147 －150.

［6］Wang Q，Li J，Zhang X，et al.Protective immunity of recomhinant Mycobacterium bovis BCG expressing rhomboid gene against Eimeria tenella challenge［J］.Vet parasitol，2009，160(3/4):198－203.

［7］李运娜，黄金贵，李建华，等.柔嫩艾美耳球虫ADF基因重组卡介苗的构建及其免疫保护性研究［J］.中国病原生物学杂志，2012，7(2):85 －88.

［8］苑淑贤，姚新华，任科研，等.堆型艾美耳球虫cSZ1基因在卡介苗中的表达及免疫保护效果研究［C］.中国会议－农业畜牧与动物医学，2011:217.

［9］何高明，孙 梅.乳酸杆菌对雏鸡巨型艾美耳球虫感染的防治试验［J］.黑龙江畜牧兽医，2005，8:50 －52.

［10］Guilian Yang，Chunfeng Wang，Fengqi Hao，et al.Studies on construction of a recombinant Eimeria tenella SO7 gene expressing Escherichia coli and its protective efficacy against homologous infection［J］.Parasitol Int，2010，6:1 － 7.

［11］徐镔蕊，王春凤，孙 哲，等.转球虫SO7基因功能乳酸杆菌对肉仔鸡感染球虫后盲肠病理学变化的影响［J］.畜牧兽医学报，2005，36(1):74 －76.

［12］王春凤，秦泽荣，徐镔蕊，等.饲喂转球虫基因功能乳酸杆菌后对雏鸡体重的影响［J］.畜牧兽医学报，2002，33(6):591－593.

［13］张 莉.疫苗级乳球菌表达载体的构建及柔嫩艾美耳球虫TA4基因的表达［D］.北京:中国农业大学，2002.

［14］邹立扣，王红宁，潘 欣.枯草芽孢杆菌整合载体研究进展［J］.生物技术通讯，2003，14(6):525 －527.

［15］黄现青，陆兆新，别小妹，等.枯草芽孢杆菌fmbJ株产生的脂肽抗球虫作用研究［J］.中国病原生物学杂志，2006，1(4):269－272.

［16］Lee K W，Lillehoj H S，Jang S I，et al.Effect of bacillus－ based direct－fed microbials on Eimeria maxima infection in broiler chickens［J］.Comp Immunol Microbiol Infect Dis，2010，33(6):105－108.

［17］Yang Guilian，Li Jianhua，Zhang Xichen，et al.Eimeria tenella:Construction of a recombinant fowlpox virus expressing rhomboid gene and its protective efficacy against homologous infection［J］.Exp parasitol，2008，119(1):30 － 36.