干细胞旁分泌效应在ALI/ARDS治疗中的研究进展*

朱 峰， 文辉才， 郭光华

(南昌大学第一附属医院1重症医学科，2整形科，3烧伤科，江西 南昌 330006)

1000-4718(2012)04-0755-05

2011-11-10

2012-02-24

国家自然科学基金资助项目(No.81060155)；江西省科技厅支撑计划(No.2010BSA10300)

△通讯作者 Tel:0791-88692533；E-mail：guogh2000@hotmail.com

干细胞旁分泌效应在ALI/ARDS治疗中的研究进展*

朱 峰1， 文辉才2， 郭光华3△

(南昌大学第一附属医院1重症医学科，2整形科，3烧伤科，江西 南昌 330006)

急性肺损伤(acute lung injury, ALI)以及它的严重形式——急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是危重病人发病和死亡的重要原因之一，最近2个世纪以来，死亡率仍在36%～44%左右[1]。ALI/ARDS的病因众多，发病机制十分复杂，涉及的环节多，受损的靶细胞多，主要涉及的环节有：炎症反应失控、细胞损伤与修复、细胞凋亡与增殖、纤溶与凝血等多个层面，这些层面彼此关联形成复杂的细胞网络和细胞因子网络。其中炎症反应失控是本质，而炎症反应失控所导致的弥漫性肺泡上皮损伤和肺内微血管内皮细胞损伤是疾病的主要病理特征。

随着ALI/ARDS发病机制研究和对机械通气并发症认识的深入，非机械通气手段作为重要的辅助治疗手段也越来越受到重视。其中，干细胞治疗ALI/ARDS的研究就是近年来颇受关注的一个领域[2-3]。研究证实，肺外干细胞具有抗炎和免疫调节作用，能改善ALI/ARDS肺内及全身的炎症反应；能“归巢”至损伤区域，向肺内多种功能细胞分化并发挥相应功能参与肺组织的修复作用[4-6]。笔者的研究小组在骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, MSCs)移植治疗烟雾吸入性损伤的研究中证实，MSCs能显著降低其全身和局部主要促炎因子水平，升高抗炎因子水平，减少血管外肺水含量，升高肺组织局部血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)水平，减轻肺和气管组织损伤程度；能“归巢”至损伤和炎症反应明显的肺组织和支气管组织区域并分化为肺泡Ⅰ型上皮细胞、肺泡Ⅱ型上皮细胞以及肺血管内皮细胞，参与并加快烟雾吸入性损伤的组织修复过程[7-9]。

随着干细胞治疗ALI/ARDS研究的深入和学术中出现的一些有争议问题，使MSCs治疗的机制研究愈来愈受到关注。MSCs在体外经诱导可以分化为骨、软骨、骨骼肌、心肌、血管内皮、神经胶质细胞、胰岛素分泌细胞等3个胚层的组织细胞，因此MSCs移植入体内分化为功能细胞替代受损细胞被认为是最主要机制。但随着对MSCs特点的深入研究，对该机制的争议颇多[10]，例如在MSCs治疗ALI的急性期即有血管外肺水肿和炎症因子、VEGF水平的改善，而MSCs在短时间内分化为功能细胞并发挥功能的可能性极小。因此，分化以外的某个机制可能成为MSCs治疗ALI的主导机制。相关领域研究证实MSCs旁分泌可溶性因子的能力可能是MSCs发挥作用的重要机制[11]。这些旁分泌的因子通过组织间隙作用于周围细胞，发挥重要的旁分泌作用(paracrine)，广泛参与免疫调节、细胞增殖、凋亡、内源性前体细胞再生、血管再生以及通过释放生长因子来改变内皮细胞或上皮细胞对损伤的反应等病理生理作用，被认为是MSCs起修复作用的重要机制之一[10]。

近年来，研究者们已经注意到了干细胞的旁分泌效应在ALI/ARDS治疗中的作用[11]，并有数个研究证实了干细胞的这一重要治疗机制[12-14]，认为MSCs干预肺疾病的病理生理过程不仅是通过其可塑性(plasticity)，还有旁分泌效应[15]。这个机制最早是由Ortiz等[16-17]证实的，他们在ALI和肺纤维化的动物模型中观察发现，全身给予MSCs能抑制几种促炎因子和促纤维化因子的表达。

MSCs可能旁分泌的物质主要有：(1)生长因子及其受体，包括血管生成素(angiopoietin, Ang)-1/2、VEGF、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、转化生长因子-β、胎盘生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板源生长因子、表皮生长因子、转化生长因子等在内的多种生长因子等；(2)细胞因子和趋化因子，包括白细胞介素-1(interleukin-1, IL-1)、白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、白细胞介素-10(interleukin-10, IL-10)以及单核细胞集落刺激因子、单核细胞趋化蛋白-1等；(3)调节肽以及其它一些相关分子,包括钠尿肽、降钙素基因相关肽、局部肾素-血管紧张素系统、内皮素和肾上腺髓质素等在内的多种调节肽以及一些特异性活性因子，包括干细胞因子、干细胞衍生因子、干细胞衍生的神经干/祖细胞支持因子等。这些干细胞旁分泌的物质在ALI/ARDS的治疗中发挥着十分重要的作用，具体表现如下。

1 抗炎和免疫调节

MSCs旁分泌的许多可溶性因子中均具有抗炎和免疫调节作用，包括IL-1受体拮抗剂、IL-10、前列腺素E2、TNF-α刺激蛋白6(TSG6)、吲哚2,3双加氧酶等[16, 18-20]。Rojas等[21]证实，MSCs能减轻肺组织对LPS诱导的炎症反应并保护肺免受损伤。研究显示，在LPS攻击后6-48h内，MSCs能防止肺水肿产生，减轻中性粒细胞在肺内的浸润，明显降低血浆前炎症因子如IL-1β、IFN-γ、巨噬细胞炎症蛋白-lα(MIP-1α)水平，保持抗炎因子IL-10和粒细胞集落刺激因子水平的稳定，促其急剧升高。深入研究还证实了受损肺细胞能诱导MSCs的迁移，而MSCs能在受损肺细胞内调节炎症信号过程[22]。同时，通过评价受损肺组织20 201个基因之间相互关系，他们还证实了在内毒素血症期间MSCs调节的可能信号途径和基因网络并绘制其相关图谱[23]。Gupta等[19]研究表明，肺内给予内毒素致ALI后4 h再给予MSCs，能改善实验大鼠48 h存活率，减少肺水和支气管肺泡灌洗液中的蛋白含量，并认为这是由于MSCs能下调内毒素所致的前炎症反应(降低支气管肺泡灌洗液、血浆中的TNF-α)和MIP-2，升高抗炎因子IL-10。因此，肺内给予MSCs能显著降低内毒素诱导ALI的严重程度，改善其预后。蔡存良等[24]经静脉移植MSCs到内毒索攻击致ALI的大鼠体内发现，MSCs移植能降低内毒素性肺损伤大鼠血浆TNF-α及IL-6水平，降低肺湿/干重比值、髓过氧化物酶活性，减轻肺泡炎症损伤。表明MSCs移植对ALI大鼠有保护作用。

2 肺泡液体清除(alveolar fluid clearance, AFC)

AFC功能受损在ALI/ARDS患者中很常见，AFC功能损害程度对判断发病率和死亡率具有显著的预后价值[25]。研究显示，肺水肿液含有多种高浓度促炎因子，包括IL-1β、IL-8、TNF-α和TGF-β1[26]，其中几个促炎因子在上皮液体转运中发挥着重要作用，特别是对钠通道(ENaC α、β、γ)和钠钾ATP酶。据知，MSCs能旁分泌多种上皮特异性生长因子，特别是角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor, KGF)。在大鼠肺内，MSCs通过上调αENaC表达和钠钾ATP酶活性来改善肺泡液体转运能力[27-28]。在内毒素诱导的ALI中，自支气管内滴入MSCs 后1h，AFC得到明显改善，这被部分地认为是因为MSCs旁分泌了KGF[29]，KGF提高了肺泡上皮细胞的液体运输。

3 修复和改善受损肺泡毛细血管屏障结构和功能障碍

肺内微血管内皮系统的完整性对防止富含蛋白的液体和炎症细胞从血浆涌入肺泡是至关重要。几个主要的MSCs旁分泌因子在这方面起着重要的作用，例如Ang-1、干细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)和KGF。Ang家族中的Ang-1不仅针对血管内皮细胞，还可以促进内皮细胞周围支持细胞的聚集，包括小血管的外膜细胞、大血管的平滑肌细胞。通过内皮周围支持细胞的聚集，包装内皮管道，不仅可以维持血管结构的完整性，还能有效防止炎症及 VEGF所致的血管通透性增加，减少渗出水肿，使新生血管结构完整，具有维持血管稳定、抗血管渗漏、抗凋亡、抗炎、促进淋巴管形成及组织液回流、减少水肿等功能。研究显示，HGF通过抑制Rho GTP酶活性，阻止肌动蛋白应力纤维形成和因凝血酶损害肺内皮细胞的细胞旁隙加大来稳定和维持肺内皮系统的完整性[30-31]。而在各种原因导致的急性通透性水肿的动物模型中，例如α-萘硫脲、绿脓杆菌以及呼吸机相关性肺炎，KGF能减轻肺水肿并减少肺泡灌洗液中蛋白的含量[32-34]。

4 趋化其它细胞参与组织修复

研究者们曾假设MSCs可能在体内分化为肺内皮细胞和上皮细胞以达到修复受损肺组织的目的。但是，这一假设被多个研究团队所质疑，因为他们观察到肺损伤模型中低于1%的MSCs移植率[35-36]，因此，移植以及分化不认为是MSCs治疗ALI/ARDS的主要作用机制，其主要作用机制被认为是“归巢”至肺损伤区域，与宿主细胞的相互作用以及旁分泌可溶性因子调节炎症反应、改变肺上皮细胞和内皮细胞对损伤的反应。虽然MSCs在有限的移植率和短时间内难以通过分化修复受损肺组织，但其旁分泌的趋化因子能吸引其它细胞参与修复。 Honczarenko等[37]发现，当人MSCs培养于无血清的特殊培养基时，能有效分泌趋化因子CCL2 (MCP-1)、CCL4 (MIP-1b)、CCL5 (RANTES)、CCL20 (MIP-3a)、CXC亚族的CXCL12 (SDF-1)、CXCL8 (IL-8)和CX3C亚族的CX3CL1。除了上述报道的外，还包括CXC亚族的CXCL1-3 (GRO)、CXCL5 (ENA-78)、CXCL6(GCP-2)、CXCL10 (IP-10)。由于趋化因子和趋化因子受体的作用，使MSCs能够在体内进行定向游走。CCR2和CXCR4分别是MCP-1和基质细胞来源因子(SDF-1)的受体，表达于MSCs表面。据报道，MSCs移植促进伴有局部放射损伤创面愈合的可能机制就是植入的MSCs所分泌的趋化因子IL-8联合IL-6、TNF-α等细胞因子有效促进了伤口周围包括中性粒细胞、嗜碱性粒细胞及T细胞在内的多种炎症细胞和修复细胞向创面移行、增殖、及早启动修复，增加了局部修复细胞的数量[38]。

5 抗菌作用

细菌性肺炎和肺外感染导致的肺损伤是ALI/ARDS常见的病因。体内实验显示，MSCs对细菌感染引起的败血症具有保护作用，能改善生存率和提高体内细菌的清除能力[39]。Gonzalez-Rey等[40]的研究证实，脂肪干细胞通过抑制炎症和Th1细胞的反应对小鼠结肠炎和败血症具有保护作用。Krasnodembskaya等[41]的实验结果显示，人MSCs通过旁分泌抗菌多肽LL-37，参与了对G-细菌的先天免疫反应。然而，在这些研究中，研究者们均没有提出确切的机制。

6 其它

MSCs旁分泌因子还具有促进血管生成、抗凋亡、代谢、防御反应和组织分化等作用，但目前关于这方面的研究还很少，不成系统，尚需进一步探索。

目前干细胞治疗ALI/ARDS的研究兴趣多集中在其旁分泌效应上。研究显示，移植入体内的干细胞能分泌诸如生长因子、细胞因子等作用于肺组织，发挥抗炎-免疫调节、促进组织修复、改善内皮和上皮通透性、修复AFC功能以及抗菌作用，是干细胞治疗ALI/ARDS以及在临床应用的重要理论基础，也是应用基因工程技术表达干细胞相关因子治疗ALI/ARDS的前提，值得重视。然而，鉴于这些研究结果主要集中在动物实验，无临床应用数据；干细胞旁分泌具体作用机制不详以及基因治疗ALI/ARDS研究的刚刚兴起，深入的研究尚需进一步开展。总之，作为一项新兴技术，干细胞移植治疗ALI/ARDS仍有着广阔前景。

[1] Dushianthan A, Grocott MP, Postle AD, et al. Acute respiratory distress syndrome and acute lung injury[J]. Postgrad Med J, 2011, 87(1031): 612-622.

[2] Gotts JE, Matthay MA. Mesenchymal stem cells and caute lung injury[J]. Crit Care Clin, 2011, 27(3): 719-733.

[3] Matthay MA, Thompson BT, Read EJ, et al. Therapeutic potential of mesenchymal stem cells for severe acute lung injury[J]. Chest, 2010, 138(4): 965-972.

[4] Yang KY, Shih HC, How CK, et al. IV delivery of induced pluripotent stem cells attenuates endotoxin-induced acute lung injury in mice[J].Chest, 2011, 140(5): 1243-1253.

[5] Pati S, Gerber MH, Menge TD, et al. Bone marrow derived mesenchymal stem cells inhibit inflammation and preserve vascular endothelial integrity in the lungs after hemorrhagic shock[J]. PLoS One, 2011, 6(9): e25171.

[6] Kim ES, Chang YS, Choi SJ, et al. Intratracheal transplantation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells attenuatesEscherichiacoli-induced acute lung injury in mice[J]. Respir Res, 2011, 12:108.

[7] 朱 峰, 郭光华, 陈 雯, 等. 骨髓间充质干细胞移植对吸入性损伤家兔炎症反应和肺组织损伤的影响[J]. 中华烧伤杂志, 2010, 26(5)：360-365.

[8] 朱 峰, 郭光华, 陈任生, 等. 骨髓间充质干细胞在烟雾吸入性损伤家兔体内向功能细胞分化的观察[J]. 中华烧伤杂志, 2011, 27(2): 150-156.

[9] 朱 峰, 郭光华, 陈 雯, 等. 骨髓间充质干细胞对烟雾吸入性损伤早期血管内皮细胞生长因子的影响[J]. 中华急诊医学杂志, 2010, 19(9)：938-941.

[10]许聿新, 赵翠红, 陈 丽. 间充质干细胞移植中的旁分泌作用[J]. 国际病理科学与临床杂志, 2008, 28(6): 525-528.

[11]Lee JW, Fang X, Krasnodembskaya A, et al. Mesenchymal stem cells for acute lung injury: role of paracrine soluble factors[J]. Stem Cells, 2011, 29(6): 913-919.

[12]Schweitzer K, Johnstone B,Cook T, et al. Paracrine effects of human adipose-derived stem cells protect against cigarette-smoke induced lung injury in A NOD/SCID-IL2 null mouse model[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2011, 183: A1248.

[13]Byrne RN, van Haaften TJ, Rey-Parra GJ, et al. Stem cell-derived paracrine activity prevents lung injury[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2009, 179: A2009.

[14]Coltan L, Morgan B, Abel M, et al. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSC) prevent airway hyperresponsiveness, inflammation and remodeling in a mouse model of asthma via paracrine-mediated mechanism[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2009, 179: A3683.

[15]Abreu SC, Antunes MA, Pelosi P, et al. Mechanisms of cellular therapy in respiratory diseases[J]. Intensive Care Med, 2011, 37(9): 1421-1431.

[16]Ortiz LA, Dutreil M, Fattman C, et al. Interleukin 1 receptor antagonist mediates the antiinflammatory and antifibrotic effect of mesenchymal stem cells during lung injury[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104(26): 11002-11007.

[17]Ortiz LA, Gambelli F, McBride C, et al. Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enhanced in response to bleomycin exposure and ameliorates its fibrotic effects[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100(14): 8407-8411.

[18]Nemeth K, Leelahavanichkul A, Yuen PS, et al. Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E2-dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production[J]. Nat Med, 2009, 15(1): 42-49.

[19]Gupta N, Su X, Popov B, et al. Intrapulmonary delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves survival and attenuates endotoxin-induced acute lung injury in mice[J]. J Immunol, 2007, 179(3): 1855-1863.

[20]Lee RH, Pulin AA, Seo MJ, et al. Intravenous HMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-inflammatory protein TSG-6[J]. Cell Stem Cell, 2009, 5(1): 54-63.

[21]Rojas M，Xu J，Woods CR，et a1．Bone marrow-derived mesenchymal stem cells in repair of the injured lung[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2005, 33(2): 145-152.

[22]Ohnishi S, Yanagawa B, Tanaka K, et a1. Transplantation of mesenchymal stem cells attenuates myocardial injury and dysfunction in a rat model of acute myocarditis[J]. J Mol Cell Cardiol, 2007, 42(1): 88-97.

[23]Iyer SS, Rojas M. Anti-inflammatory effects of mesenchymal stem cells: novel concept for future therapies[J]. Expert Opin Biol Ther, 2008, 8(5): 569-581．

[24]蔡存良，文仲光，周 岗，等．骨髓间充质干细胞移植对急性肺损伤大鼠血浆TNF-α、IL-6水平的影响[J]．感染、炎症、修复, 2006, 7(2)：98-101．

[25]Ware LB, Matthay MA. Alveolar fluid clearance is impaired in the majority of patients with acute lung injury and the acute respiratory distress syndrome[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2001, 163(6): 1376-1383.

[26]Lee JW, Fang X, Dolganov G, et al. Acute lung injury edema fluid decreases net fluid transport across human alveolar epithelial type II cells[J]. J Biol Chem, 2007, 282(33): 24109-24119.

[27]Wang Y, Folkesson HG, Jayr C, et al. Alveolar epithelial fluid transport can be simultaneously upregulated by both KGF and beta-agonist therapy[J]. J Appl Physiol, 1999, 87(5): 1852-1860.

[28]Guery BP, Mason CM, Dobard EP, et al. Keratinocyte growth factor increases transalveolar sodium reabsorption in normal and injured rat lungs[J]. Am J Respir Crit Care Med, 1997, 155(5): 1777-1784.

[29]Lee JW, Fang X, Gupta N, et al. Allogeneic human mesenchymal stem cells for treatment ofE.coliendotoxin-induced acute lung injury in theexvivoperfused human lung[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009, 106(38): 16357-16362.

[30]Birukova AA, Alekseeva E, Mikaelyan A, et al. HGF attenuates thrombin-induced endothelial permeability by Tiam1-mediated activation of the Rac pathway and by Tiam1/Rac-dependent inhibition of the Rho pathway[J]. FASEB J, 2007, 21(11): 2776-2786.

[31]Singleton PA, Salgia R, Moreno-Vinasco L, et al. CD44 regulates hepatocyte growth factor-mediated vascular integrity. Role of c-met, Tiam1/Rac1, dynamin 2, and cortactin[J]. J Biol Chem, 2007, 282(42): 30643-30657.

[32]Viget NB, Guery BP, Ader F, et al. Keratinocyte growth factor protects against Pseudomonas aeruginosa-induced lung injury[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2000, 279(6): L1199-L1209.

[33]Mason CM, Guery BP, Summer WR, et al. Keratinocyte growth factor attenuates lung leak induced by alpha-naphthylthiourea in rats[J]. Crit Care Med, 1996, 24(6): 925-931.

[34]Welsh DA, Summer WR, Dobard EP, et al. Keratinocyte growth factor prevents ventilator-induced lung injury in anexvivorat model[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2000, 162(3 Pt 1): 1081-1086.

[35]Kotton DN, Fabian AJ, Mulligan RC. Failure of bone marrow to reconstitute lung epithelium[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2005, 33(4): 328-334.

[36] Loi R, Beckett T, Goncz KK, et al. Limited restoration of cystic fibrosis lung epitheliuminvivowith adult bone marrow-derived cells[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2006, 173(2): 171-179.

[37]Honczarenko M, Le Y, Swierkowski M, et al. Human bone marrow stromal cells express a distinct set of biologically functional chemokine receptors[J]. Stem Cells, 2006, 24(4): 1030-1041.

[38]艾国平, 栗永萍, 闫国和, 等. 骨髓间充质干细胞对合并局部放射损伤创面促愈作用及机理研究[J]. 中华医学杂志, 2002, 82(23): 1632-1636.

[39]Mei SH, Haitsma JJ, Dos Santos CC, et al. Mesenchymal stem cells reduce inflammation while enhancing bacterial clearance and improving survival in sepsis[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2010,182(8): 1047-1057.

[40]Gonzalez-Rey E, Anderson P, Gonzalez MA, et al. Human adult stem cells derived from adipose tissue protect against experimental colitis and sepsis[J]. Gut, 2009, 58(7): 929-939.

[41]Krasnodembskaya A, Song Y, Fang X, et al. Antibacterial effect of human mesenchymal stem cells is mediated in part from secretion of the antimicrobial peptide LL-37[J]. Stem Cells, 2010, 28(12): 2229-2238.

Paracrineeffectofstemcellsontreatmentofacutelunginjury/acuterespiratorydistresssyndrome

ZHU Feng1, WEN Hui-cai2, GUO Guang-hua3

(1DepartmentofCriticalCareMedicine,2DepartmentofPlasticSurgery,3DepartmentofBurning,TheFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China.E-mail:guogh2000@hotmail.com)

Acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS) represent the leading cause of morbidity and mortality in critical patients. Despite improvements in supportive care and mechanical ventilation, recent data indicate that the mortality of ALI/ARDS is still high. Cell-based therapy with stem cells is an attractive new therapeutic approach. Stem cells have the capacity to secrete multiple paracrine factors that can regulate inflammation, improve alveolar fluid clearance, regulate endothelial and epithelial permeability, enhance tissue repair via chemotaxis and inhibit bacterial growth. This review focuses on the recent studies, which support the potential therapeutic use of stem cells in ALI/ARDS with an emphasis on the role of paracrine soluble factors.

干细胞; 急性肺损伤; 呼吸窘迫综合征，急性

Stem cells; Acute lung injury; Respiratory distress syndrome,acute

R563

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.033