大鼠血管性痴呆动物模型的研究进展

曾贵刚，李 峻，彭海东，谢施海，张 申

（第二军医大学附属上海长征医院中医理疗科，上海 200003）

血管性痴呆（vascular dementia，VD）是由缺血、出血或急慢性脑缺氧等脑血管因素，导致脑组织损害，引起的脑组织血液循环障碍、脑功能减退的一种认知功能缺损综合征。患者多为慢性、进行性、持续性智能障碍综合征，临床表现为记忆及认知等功能障碍综合征［1］。建立VD动物模型，对深入探讨该病的发病机制、病理学特点以及临床患者的早期诊断和治疗等均有重要意义。大鼠与人类均由颈动脉系及椎底动脉系吻合成动脉环，通过其分支共同完成脑供血，有相似的脑血管解剖特点。且大鼠较其他动物价格便宜、生存率高、繁殖快、易饲养、便于检测，有较强的生命力和抗感染能力，目前是制备 VD模型最适宜的动物［2］。本文现将大鼠VD动物模型的研究进展综述如下：

1 模型制作方法

1.1 血管阻断法

两血管阻断法（2-VO）：2-VO法是指将大鼠的双侧颈总动脉（common carotid artery，CCA）永久结扎，造成一种慢性脑低灌注状态，从而使脑组织，尤其是易损区域，如海马、皮层等产生缺血缺氧性损害。2-VO法制作相对简单，但术中大鼠死亡率较高，难以长期存活，不利于长期观察。近年来，学者对2-VO法采用了多种改进方法：

① 分次结扎颈总动脉法。研究发现［3］，改进的2-VO法（间隔1星期，分2次结扎颈总动脉），可大大降低动物的死亡率，且与传统法造模组的大鼠海马区神经元有相似程度的明显变性、坏死和凋亡［4］，在 Morris水迷宫测试中定位航行实验，空间搜索实验结果也证实了分次结扎颈总动脉法对动物行为学的影响与传统造模方法无显著差异［5］。但仅结扎双侧颈总动脉，由于大脑动脉环的代偿作用，侧支循环的建立，有可能难以达到理想的脑缺血，从而影响模型的可靠性，因此还出现了2-VO复合法制作VD模型，较好地避免了这些问题。

②2-VO法+高血脂症：将大鼠高脂饲料喂养1月，确证其血脂己升高后，再用2-VO法。缺血时闭阻双侧颈总动脉 3次，每次 10 m in，每次间隔 10 min，之后缝合伤口即制成高脂血症 VD模型［6-7］。此法模拟了VD发病中高脂血症危险因素，与人类实际情况有很高的相似度。

③ 肾血管性高血压模型［8］。用动脉夹夹闭大鼠双侧肾动脉，复制出易卒中型肾血管性高血压大鼠模型，于43 d后夹持阻断——再通双侧颈总动脉。此法的不同在于考虑到VD易发生的危险因素，能较好地模拟人类VD发病的病理过程。实验证明此模型易发生与人类高血压病类似的脑动脉损害，在此基础上，56％的大鼠自发产生各种类型的脑卒中。

④ 反复缺血—再灌注合并腹腔注射硝普钠［9］。其目的为降低大鼠血压，以加重脑的缺血性损伤。大鼠模型在夹闭双侧 CCA之前，腹腔注射硝普钠（2.5 mg/kg，用无菌蒸馏水溶解），随即用无创动脉夹夹闭双侧CCA，10 min后，再通10 min，再夹闭10 min，再通后缝合伤口，放回笼中饲养。本法重复性、稳定性较好；手术操作简单；对动物创伤小，易于恢复，存活率高；与临床上VD发病过程相似。但本法对硝普钠注射量以及环境恒定温度要求较高，否则会对血压造成影响，进而影响造模效果［10］。

三血管阻断法（3-VO）：该方法阻断动物基底动脉和双侧颈总动脉血供，制成一种慢性脑供血不足（chronic cerebral circulation insuffciency，CCCI）模型。研究发现老龄大鼠CCCI模型所引起的行为学及神经病理学损害更接近阿尔茨海默病，而与多发血管梗塞性痴呆有所不同，此方法国内学者较少采用［11］。此外，还有学者采用三血管阻断再开放法，与单纯3-VO法比较，该方法优点在于缺血较为迅速，缺血效果好，再灌注血流恢复迅速，比较适用于急性全脑缺血性疾病损伤的研究。缺点是需开颅暴露基底动脉，手术创伤大，在手术中对周围组织、神经牵拉较重，尤其是在暴露及夹闭基底动脉时，易损延髓［12］。

四血管阻断法（4-VO）：1979年，Pusinelli最先采用此法，故又称Pusinelli4-VO法。其方法为先阻断大鼠双侧椎动脉，再可逆性夹闭双侧颈总动脉，导致全脑缺血，进而导致 VD。此法可导致大鼠前脑严重缺血，海马等与大鼠智能相关部位受损严重，而脑干部分由于有脊前动脉的供血尚能维持正常的生理状态。4-VO为目前国际公认的VD造模方法，它高度模拟VD的发病特点，缺血后生理指标稳定，病理改变较为充分、明确，无明显肢体运动障碍，但该方法手术复杂，具有一定操作难度，由于创伤较重，大鼠生存率低［13］，在非直视条件阻断双侧椎动脉导致模型制作结果难以肯定。

1.2 血管栓塞法

本方法主要采用从大鼠一侧颈内动脉注入纤维蛋白、血凝块、中心球、塑料微小栓子及血栓诱导剂致缺血性中风模型，在VD模型制作方面，主要有自体血栓注入法及舌下静脉铁粉注入法。

血栓法：血栓法是制作VD动物模型较为常用的方法之一。其方法［14］为将外源性栓子注入动物体内，造成多发性脑梗塞。此种方法最先由 Kudo等人于1982年首次提出，即将小于100μm的同种血栓栓子从大鼠颈总动脉注入，造成同侧皮质、海马和深部灰质的梗塞。其后，Kaneko等在 Kudo方法的基础上加以改进，从颈外动脉逆行插管至颈内动脉，然后推栓子进入颅内，造成缺血模型，克服了结扎颈总动脉的缺点。1994年，我国学者陈俊抛等，采用自体干燥血块，研碎后经200微米筛孔过筛，然后将小于200μm的栓子盐水混悬液从颈外动脉注入，注入量为0.5 m L。术后经行为学检测及病理学观察证实模型制作是成功的。但此种方法操作较困难，梗塞灶大小不易控制及动物死亡率较高。梅建勋等［15］将此法加以改进：在操作时将栓子溶液量减少至0.3 m L，且延长注入时间（不少于30 s），再注入栓子的同时开放颈总动脉，利用颈总动脉的血流将栓子送入颅内。这样使造模后形成的多发梗塞灶更接近于临床VD患者病理改变，同时减少栓子溶液量可以降低模型的死亡率。

铁粉注入法：林坚等人［16］将四氧化三铁粉（铁离子直径6μm，用量56.4 mg/kg）溶于1.5 m L生理盐水中，于1 min内沿大鼠舌下静脉注入，并将大鼠麻醉后固定在脑立体定位仪上，常规消毒，暴露颅骨，在额部位于前囟前2 mm向左旁开2 mm处安置电极，并在其正后方固定一直径5 mm，2000高斯磁场的小磁铁制作VD动物模型。经统计学及形态学检查结果表明，本法所形成的VD模型可作为实验性脑缺血的动物模型。赵小贞等［17］用类似方法，所不同之处为从鼠尾静脉注射铁粉。本法操作简单，可重复性强，术中不必开颅，适用于慢性实验，但仅模拟了单一部位的缺血梗死，而且铁粉停留肺、肝中，影响生活质量及日后药物干预的观察，与大脑多发性梗塞以及与痴呆的关系还需进一步研究。

1.3 大脑中动脉梗死法

大脑中动脉阻塞模型是局部脑缺血动物模型，与临床上患者半球局灶性梗塞高度近似。尹军祥，赵玲等［18-19］采用大鼠麻醉后开颅暴露大脑中动脉（m iddle cerebral artery，MCA），将蘸有FeCl3溶液的滤纸敷在MCA上，待MCA变黑，取下滤纸，缝合伤口。蔡晶等［20］采用用电凝器热凝固 MCA主干，崔尧元，关云谦等［21］从颈总动脉 CCA切口插线经颈内动脉到达MCA，实现MCA阻塞导致脑缺血，制作大脑中动脉梗死模型。大脑中动脉梗死法缺血效果可靠，MCA供血区有典型的神经细胞缺血、坏死梗塞灶，模型动物有明显的学习记忆障碍，缺血灶明确、可重复性强，但本法操作技巧性要求高，大鼠创伤大，死亡率高。

1.4 光化学法

杨渊等［22］研究老年大鼠局灶性脑梗死运用此法。大鼠经腹腔麻醉后，消毒并纵向切开头皮，暴露右侧颅骨，剥离颅骨表面骨膜并覆以中间带圆孔的避光纸，冷光源照射颅骨。动物体内的光敏染料引起内皮细胞过氧化，释放自由基，致内皮损伤，诱发血小板凝聚，血管内血栓形成。韩冬等［23］采取去除颅骨上层骨板及中央髓层，保留下层骨板的方法。此模型梗死部位恒定，手术过程简单，动物存活率高，短时间内可以制作较大量的模型。但该法由于微血管损害和血脑屏障开放早，与人类常见的缺血性脑卒中存在差异，且光敏物质对实验可能存在干扰。

1.5 VD自发模型

1963年，Okamoto和Aoki培育了自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rat，SHR），其中有一重要亚系Stroke-Prone SHR（自发性高血压脑卒中倾向大鼠）。这个亚系中，80％超过100日龄雄性大鼠和60％超过150日龄雌性大鼠发生脑出血。SHR大鼠在出生后前几个月时间内能够自行发展成为稳定的高血压，同时伴随出现高血压相关的包括脑组织在内的多种靶器官损伤［24］，可从脑出血后存活的大鼠中筛选VD模型大鼠，以供科研［25］。SHR大鼠作为研究原发性高血压的重要动物模型，涉及不同层次的多个脑区，例如脑血管、血脑屏障、海马CA1区、纹状体、齿状回等，均出现多种病理改变，且随高血压程度的不断加深而加重。最终表现为认知功能损伤等行为学改变。脑血管因素与长期高血压常常合并产生VD，共同导致认知功能缺损，以往研究多以正常大鼠为基础制作VD模型，反应了持续低灌流对大脑的损害，但不能模拟在长期高血压基础上大脑持续低灌流所产生的VD，SHR大鼠可以很好地模拟长期高血压与持续低灌流两种因素共同导致的VD，与长期高血压后中风导致的VD病例有很高的相似度［26］。但 SHR大鼠来源有限，价格较昂贵，不宜大规模的研究开展；且其与临床非高血压VD患者在多危险因素共同作用下的发病情况有所不同，不能完全模仿其脑损伤及功能障碍情况［27］。

1.6 去大脑皮层法

司楚银等［28］首次报道去大脑皮层法。大鼠麻醉后暴露软脑膜，在解剖显微镜下用棉签擦拭至软脑膜下见不到血管为止，术后动物出现明显的学习记忆功能损害。在组织病理染色中，皮质、海马等处细胞构筑明显遭到破坏，细胞数量明显减少且变形萎缩，充分模拟了VD的病理改变。缺点在于打开硬脑膜时损及脑脊液，同时可能损及硬脑膜窦，导致动物死亡。

2 模型观察指标

2.1 行为学指标

学习及记忆是大脑的高级神经电生理活动，VD模型可表现为学习和记忆功能减退，学习记忆能力的常作为其重要的观察评价指标。学习侧重于对行为变化的获得，而记忆侧重于对行为变化的保持、回忆和储存。通过水迷宫法、跳台法、避暗法、电迷宫法、爬杆法、穿梭箱等行为学检测来测定VD模型的学习记忆能力，其中Morris水迷宫是检测大鼠空间学习记忆能力常用的装置［29］，通过定位航行试验和空间探索试验分别测试VD模型的学习和记忆能力。研究［30］表明在定位航行试验中造模后VD模型大鼠平均逃避潜伏期较对照组显著延长，在空间探索试验中VD模型寻找原平台象限的游泳轨迹呈随机紊乱分布，而正常大鼠游泳轨迹基本上集中在平台象限，VD模型大鼠首次跨越原平台时间（逃避潜伏期）明显延长，跨越原平台频率明显少于对照组大鼠。

2.2 组织形态学观察

海马是脑内参与记忆贮存功能的重要部分，在学习记忆中起重要作用。在VD模型的研究中多以皮质及海马区的神经细胞的变化作为观察指标。模型组见锥体细胞排列紊乱，胞体肿胀，胞膜溶解，有空泡产生，出现核固缩，核裂解，胶质细胞增生形成多处结节［31］。海马 CA3区微管相关蛋白-2 （MAP-2）神经元树缺血再灌1 d后突断裂不完整，粗细不一致，再灌7 d和14 d突起表达更加紊乱，可观察到螺旋样变；再灌30 d突起表达依然断裂不完整；再灌 90 d突起较平滑完整，形态学基本恢复［32］。大鼠血管性痴呆后第1天，侧脑室下区、室管膜等相关神经生发区有少量5-溴脱氧尿核苷（BrdU）阳性神经元，阳性神经元细胞核呈棕黄色，细胞浆不着色，第2天，第7天阳性细胞数逐渐增多［33］。Nanri等［34］研究发现，大鼠在2-VO后1～3 d出现脑白质疏松，海马区及皮层神经元皱缩，7 d后纹状体区出现梗塞病灶。

2.3 血液生化指标

研究发现模型组大鼠皮质和海马组织中乙酰胆碱（Ach）含量持续降低［35-36］。2-VO后3～7 d微管相关蛋白-2（MAP-2）免疫活性下降，而胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫活性增加；在 2-VO后 30 dGFAP的免疫活性达到高峰［37］。模型组大脑皮质和海马肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及白细胞介素-1β （IL-1β）含量显著高于假手术组，模型组大脑皮质和海马一氧化氮NO含量及一氧化氮合酶NOS活力显著高于假手术组，模型组大脑皮质和海马超氧化物歧化酶（SOD）活性显著低于假手术组，丙二醛（MDA）含量显著高于假手术组［38］，研究结果显示，模型组大鼠脑缺血再灌注后脑组织内内皮素ET水平明显高于假手术组，降钙素基因相关肽（CGRP）水平明显降低［39］。大鼠大脑边缘叶八肽胆囊收缩素（CCK-8）含量的正常组显著高于 VD模型组［40］。在AD的发病过程中，血管收缩因子血栓素 A2 （TXA2）与血管扩张因子前列腺素（PGI2）的相互制衡对于维持正常血液循环也起到了重要作用，能通过对血管平滑肌的影响调节血管的内环境恒定，脑缺血时它们的代谢产物 TXB2含量增高，同时6-Keto-PGF1α含量降低［41］。VD模型组大鼠有明显血液流变学障碍，其全血黏度，血浆黏度，红细胞压积及血沉均明显升高［38］，大鼠海马、皮层和其它一些与学习记忆功能相关的脑区在2-VO后2～5 h，局部脑血流量降低25％～87％，葡萄糖利用率下降66％～77％。

2.4 影像学指标

随着神经影像学技术的发展，临床根据脑血流、脑葡萄糖代谢、氧代谢、神经递质及其受体的活性，来评价VD患者活体脑组织的局部神经功能逐渐开展［42-43］。脑血流灌注成像技术能够提供客观的脑血流量指标，反映慢性脑缺血患者的脑灌注状态，目前用于评价脑血流量的方法有功能性磁共振（fMRI）等影像学技术。MRI等影像学技术可同时从血管结构、脑组织功能、代谢上敏感地显示大脑低灌注损伤的范围和程度［44］。影像学检测在动物模型上近来也逐渐有学者开始采用，曾贵刚等［45］采用fMRI检测大鼠局灶性脑缺血（MCAO）模型的梗死部位、血管阻塞、神经纤维束等情况，发现大鼠术侧颞顶叶及外侧出现明显水肿带，脑血管完全堵塞，神经纤维束稀少，部分纤维束中断、缺失；等级相关性分析显示，神经功能缺失评分与脑梗死比例具有相关性，可准确判断活体状态下大鼠脑卒中模型的损伤部位和程度，筛选出一致性较好的大鼠脑卒中模型。但采用血氧水平依赖性功能性磁共振成像（BOLD-fMRI）检测VD模型时，动物处于全麻状态下进行的被动运动，大脑皮层激活点无固定规律，与人体试验存在很大差异，提示不适用于检测大鼠全麻状态下被动运动的激活部位［46］。

综上所述，VD是一个极其复杂的病理生理过程，模拟人类缺血性脑血管病发病过程，建立重复性好、生理指标控制严格、利于病理指标观察的标准化活体VD动物模型，在VD的研究中有着重要意义。近年对VD动物模型的研究取得了长足的进步，但仍存在着许多问题亟待解决。现有VD模型有的仅能造成缺血再灌注，学习记忆的功能减退是短暂可逆的［47］，仅能模拟单一动脉阻塞形成的局部急性脑梗塞；有的仅能模拟慢性低灌流对VD形成的影响；还有的需开颅手术，创伤大、动物死亡率高、不易操作。目前VD模型存在的问题在于：通过各种造模方法制作的动物模型，其病理生理的改变不能充分模拟和反映临床VD的特征，或在造模过程中人为增加了一些非VD的病理生理特征（如铁粉栓塞法增加了肺、肝等内脏铁粉残留；去大脑皮层法改变了脑脊液状态）。为了使研究成果尽可能真实地反映VD的病理生理过程，研究者在进行VD的相关研究中，应根据其研究目的和当前众多VD造模方法的各自特点，选取合适的造模方法。此外，由于寻找新的VD模型造模方法较为困难，充分研究和挖掘现有各VD造模方法的异同和特点，指导VD研究采用最恰当的造模方法，也是VD模型造模方法研究的一个新方向。随着科学技术的发展，以及新材料、新方法的应用，VD动物模型的制作将会取得更深层次的突破，必将对VD的临床及实验研究起到更大的推动作用。

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