转基因鼠在脑缺血氧化应激研究中的应用

王译晗，张 霞，张婷慧，张予阳

(沈阳药科大学生命科学与生物制药学院，沈阳 110016)

氧化应激是指活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)过量超出了细胞对ROS清除的能力，最终引发疾病［1］。ROS通过氧化反应破坏脂质、蛋白质和DNA等大分子物质，也参与炎细胞的激活及其信号的级联放大过程，导致细胞损伤甚至死亡，它还介导脑缺血再灌注损伤［2］。脑缺血时，ROS的产生和清除平衡遭到破坏，抗氧化酶与促氧化酶的数量及功能平衡失调，它们可做为细胞内信号参与细胞死亡信号通路的传递，最终导致细胞损伤乃至死 亡。超 氧 化 物歧 化 酶 (superoxygenerized degenerase，SOD)是脑缺血氧化应激中具有抗氧化作用的主要酶之一，它能催化歧化超氧阴离子生成H2O2，而后经谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)或过氧化氢酶(catalase，CAT)催化生成水。一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)则可催化NO的生成，后者与超氧阴离子反应形成过氧化亚硝酸盐，过量的NO和过氧化亚硝酸盐对缺血脑组织均可造成损害。

应用转基因技术可获得基因嵌合小鼠，嵌合小鼠与野生小鼠进行交配产生杂合(+/-)后代，杂合小鼠繁殖可产生纯合小鼠(+/+为高表达，-/-为基因敲除)［3］。这些转基因及基因敲除鼠发育正常，无明显病理变化，可用于研究缺血性脑损伤的机制及药物的作用。近年来，转基因技术的发展使ROS在脑缺血中的致病机制变得更易准确定位。

1 基于转基因鼠对一氧化氮合酶NOS的研究

在哺乳动物脑内，NOS有三种亚型，即神经型NOS(neuronal NOS，nNOS)、诱导型 NOS(inducible NOS，iNOS)及内皮型NOS(endothelial NOS，eNOS)。Ito等［4］利用脑缺血后 nNOS(-/-)小鼠和 eNOS (-/-)小鼠对比发现，nNOS(-/-)小鼠的脑血流量高于野生型小鼠，eNOS(-/-)小鼠的平均动脉压高于野生型小鼠，这说明nNOS可能在缺血再灌注过程中对控制脑血流量发挥着重要作用，由nNOS催化产生的NO与超氧自由基形成过氧化亚硝酸盐而产生神经毒性作用，并加重缺血性损伤［5］，相反，由eNOS催化产生的NO是维持血管张力和功能［6］及增加脑血流量的重要决定因素。另外，缺血再灌注后，eNOS(-/-)和 nNOS(-/-)小鼠纹状体处的NO3-水平与野生型小鼠相比显著减少，这提示在缺血再灌注过程中有些脑区产生的NO3-与 nNOS和 eNOS二者的活性密切相关。此外，缺血再灌注后，nNOS(-/-)小鼠脑中NO3-的含量明显低于eNOS(-/-)小鼠，进一步表明脑缺血后 nNOS催化产生的NO占主导地位［4］。用eNOS(-/-)小鼠制备大脑中动脉闭塞的局灶脑缺血模型，与野生型小鼠相比，可造成较高的死亡率和严重的神经学症状，并降低了动脉生成［7］，提示eNOS可介导缺血大脑的动脉生成，并与中风后的功能恢复密切相关。

Atochin等［8］发现，将内源性 eNOS的丝氨酸1179位点磷酸化可影响血管的反应性并决定脑梗死范围的大小，表达丝氨酸 1179磷酸化 eNOS (S1179D)的转基因小鼠与表达丝氨酸1179非磷酸化eNOS(S1179A)的转基因小鼠相比，血管反应性增加，大脑中动脉闭塞后的脑血流量也明显增加。此外，将eNOS(-/-)小鼠与S1179A和S1179D的转基因小鼠交配，产生以eNOS(-/-)小鼠为背景的S1179D/eNOS敲除小鼠和S1179A/eNOS敲除小鼠，发现 eNOS(-/-)小鼠及 S1179A/eNOS基因敲除小鼠均比野生型小鼠及S1179D/eNOS基因敲除小鼠不能耐受缺血性脑损伤，局灶脑缺血后脑梗死范围增加，提示eNOS或将eNOS修改为S1179D均对脑缺血损伤具有保护作用。Pruss等［9］研究发现iNOS(-/-)小鼠局灶脑缺血后梗死范围增加。Luo等［10］利用基因敲除小鼠研究发现，iNOS是脑缺血后诱导齿状回细胞形成的重要因素。而nNOS对小鼠脑的细胞形成起着相反作用，抑制nNOS能促进齿状回细胞形成。

在缺血预处理阶段，nNOS(-/-)小鼠与eNOS (-/-)小鼠均没有表现出缺血耐受性［11］，然而Cho等［12］利用iNOS(-/-)小鼠进行研究则发现，iNOS可加强小鼠的缺血耐受性，对随后的脑缺血损害起到一定保护作用。此外，Kawano等［13］人分别利用缺乏NADPH氧化酶(NOX)的Nox2亚基的小鼠和缺少 iNOS的转基因小鼠进行研究发现，iNOS催化产生的NO若要在缺血预处理阶段发挥神经保护作用，与NADPH氧化酶催化产生的超氧化物所形成的过氧化亚硝酸盐形成复合物是必要条件，此研究结果提示，过氧化亚硝酸盐除了具有众所周知的加重脑缺血损伤及神经退行性病变作用，在缺血预处理阶段还能间接起到保护脑缺血的有益作用。

2 基于转基因鼠对超氧化物歧化酶SOD的研究

SOD有三种同功酶，包括胞质酶 CuZnSOD (SOD1)、线粒体酶 MnSOD(SOD2)和细胞外酶ECSOD(SOD3)，它们分别存在于细胞的不同部位，为ROS引起的脑缺血损伤提供保护作用。许多研究已证明了它们对脑缺血/再灌注损伤的神经保护作用是确切的。

大量研究表明，SOD1转基因小鼠及大鼠具有抵抗脑缺血损伤的能力［14］，纯合的SOD1(-/-)小鼠在局灶性脑缺血后，脑梗死范围增加，脑水肿程度加重［15］，暂时性全脑缺血后，神经元死亡数增加，尤其是海马CA1区的神经元损伤更明显［16］。但有文献报道，在新生小鼠的大脑中，SOD1高度表达却可使神经元死亡数增加。显然，在特定情况下，SOD1的作用未必与我们在成年鼠上获得的结果相同。而GSH-Px高表达则可对抗新生鼠的脑缺血缺氧损伤［3］。这可能是由于在SOD1转基因鼠脑内有较多的H2O2蓄积，而新生鼠的大脑却没有足够的下游酶对抗H2O2的蓄积［3］。该研究进一步表明了中枢神经系统中抗氧化体系中各种酶之间相互协调的重要性。

此外，SOD1还参与调节脑缺血后线粒体功能障碍，并参与调节氧化应激状态对神经元的影响过程。研究发现，SOD1高表达可减少早期的细胞色素C(cytochrome C，Cyt C)及次生半胱天冬酶线粒体源激活剂 (second mitochondria-derived activator of caspase，Smac)从线粒体向胞质释放，减少caspases-3的激活［17］，并加强凋亡蛋白 X染色质联结的凋亡抑制剂(x chromosome-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)与caspase-9的相互作用，从而抑制内源性凋亡caspases通路的启动［18］，抑制细胞凋亡的线粒体信号途径，对脑缺血后的神经元损伤起到保护作用。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(蛋白激酶 B，PKB，Akt)活化作为防止细胞凋亡的重要因素之一，与暂时性局灶脑缺血后的细胞存活涉及的信号转导途径有关。暂时性局灶脑缺血30m in后，加强Akt的磷酸化可减少超氧化物的产生及增加 SOD1的表达，研究结果显示，与野生型小鼠相比，SOD1转基因小鼠的尾壳核及缺血皮质脑区中Akt的磷酸化程度有所增加［19］。在脑缺血时，暂时性局灶脑缺血引起的氧化应激可增加NF-κB(nuclear factor-kappa B)的含量，触发其相应的细胞信号转导通路，使神经元受损，SOD1高表达鼠，氧化应激状态减轻，可加强与NF-κB相关的快速防卫机制，从而防止脑缺血诱导的氧化应激所致的大脑损伤［20］。显然，抗氧化应激作用可通过活化 Akt和抑制 NF-κB相关的信号通路，减轻神经元的受损程度。

众所周知，脑缺血后的再灌注阶段尤其易引发氧化应激性损伤，而 SOD1高表达能降低神经元对此过程中各种有害因子的敏感性。与维持细胞存活的信号途径相反，局灶性脑缺血后促凋亡基因p53上调，SOD1高表达后这种上调受到抑制［21］。此外，p53上调细胞凋亡调控因子(the p53upregulated modulator of apoptosis，PUMA)也受 p53诱导，产生后与 Bcl-2凋亡调控家族相互作用，致Cyt C向胞质释放增多［22］，然而暂时性全脑缺血后PUMA的上调，在 SOD1高表达动物中却明显受到抑制［23］。这些基于转基因动物的研究结果提示，SOD1可通过多种相互关联的细胞信号途径，抑制脑缺血或缺血再灌注中ROS对组织细胞的有害作用。

O2-主要来源于线粒体呼吸过程，而SOD2作为一种线粒体酶，在正常生理状态下与O2-的水平密切相关，SOD2转基因鼠的研究在脑缺血氧化应激的作用机制探讨中具有重要价值。有报道，SOD2(-/-)小鼠与野生型小鼠相比，脑缺血后，线粒体功能紊乱、脑梗死范围、脑水肿及O2-的产生均有增加［1］，线粒体Cyt C向胞质的释放、caspase-9的激活也有所增加［24］。携带人类 SOD2基因的杂合 SOD2转基因小鼠，局灶性脑缺血后，脑组织损伤减轻，血管内皮细胞死亡减少，研究还发现，信号转导和转录 激 活 子-3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)是一种 SOD2基因表达的转录调控因子，参与SOD2的神经保护过程，显然此发现为脑缺血再灌注损伤的治疗提供了新靶点［25］。

SOD3是一种细胞外超氧化物歧化酶，相对于前述两种超氧化物歧化酶亚型而言，其含量较低，但因其所在的细胞外空间较大，使得它在中枢神经系统内具有相对较高的水平。SOD3高表达小鼠在暂时性全脑缺血后，神经元死亡有所减少［26］。与此相反，纯合的SOD3(-/-)小鼠，局灶性脑缺血后脑梗死范围有所增加［27］。显然，在脑缺血损伤研究中，SOD3转基因鼠具有与SOD2转基因鼠同样重要的意义。

转基因和基因敲除鼠为脑缺血的机制研究及治疗脑缺血的药物研究提供了重要条件。目前，多种模拟SOD的化合物和被修饰的SOD化合物已经不同程度的得到开发研究，进一步的数据也已证实，它们对脑缺血损伤具有明显的保护作用。今后，在深入研究三种同功酶的协同作用时，可尝试将两种或三种超氧化物歧化酶亚型同时在实验动物脑中高表达或敲除，从而更清晰的建立其相互作用及协同作用模式，为深入探讨这种相互作用或协同作用的精细机制提供必要条件。

3 基于转基因鼠对谷胱甘肽过氧化物酶 GSH-Px的研究

GSH-Px存在于胞质中，而 CAT则主要集中于过氧化酶体，显然，GSH-Px的普遍存在预示了它对调节过量 H2O2具有更重要的作用。利用 GSH-Px高表达小鼠或GSH-Px(-/-)小鼠，对局灶脑缺血或脑缺血再灌注损伤进行研究，结果表明，GSH-Px高表达可减少神经元的坏死和凋亡，抑制星型胶质细胞的活化及炎细胞的浸润［28］，相反，GSH-Px敲除可见氧化应激水平增加、脑缺血再灌注损伤明显加重［29］。对于新生小鼠，GSH-Px的增加具有同样的保护作用，GSH-Px是一种将H2O2转化为水必不可少的催化酶，因此与野生型小鼠相比，GSH-Px转基因新生小鼠脑内蓄积较少的H2O2，GSH-Px高表达使新生小鼠的脑缺血缺氧损伤明显降低［30］。前已述及与成年鼠不同的是，SOD1高表达对新生鼠脑缺血缺氧损伤无明显保护作用，NOS抑制剂不能使SOD1对新生鼠脑缺血缺氧损伤产生有益影响，但SOD1和GSH-Px共同高表达则对新生小鼠脑缺血缺氧损伤呈现有益作用，在这种转基因新生小鼠中获得的神经保护作用优于单独SOD1高表达的转基因新生小鼠［30］。GSH-Px(+/+)小鼠的研究表明，GSH-Px对H2O2及过氧化脂质造成的氧化应激性脑损伤具有保护作用，依布硒(一种GSH-Px的仿制品)具有神经保护作用的报道［3］，进一步支持了GSH-Px对氧化应激性脑损伤具有有益作用的假想。

4 基于转基因鼠对NADPH氧化酶NOX的研究

NOX是大脑中的一种促氧化酶，许多刺激因素可使其活化，它可诱导4种胞质亚基向细胞膜易位，并与催化亚基融合形成复合体，这种活化酶复合体可给氧运输电子，从而生成超氧阴离子(O2-)，因此，NOX在脑缺血和其他与氧化应激相关的疾病中起有害作用。

夹竹桃麻素是目前应用最广泛的NOX家族蛋白抑制剂，脑缺血后给予Nox2(-/-)小鼠夹竹桃麻素处理，没有表现出保护脑缺血损伤及减少脑内ROS的作用［31］。脑缺血再灌注导致血脑屏障破坏进而形成脑水肿，ROS可破坏血脑屏障，NADPH氧化酶的Nox2亚基催化活性氧的生成，因此，这种酶的基因缺失或抑制该酶的活性可保护脑缺血再灌注后的血脑屏障功能。Kahles等［32］利用Nox2(-/-)小鼠进行研究发现，Nox2基因缺失可防止早期血脑屏障功能障碍，预防脑缺血后的脑水肿形成，夹竹桃麻素因抑制NOX的活性从而对维持血脑屏障功能起有益作用。此外，脑缺血再灌注后Nox2(-/-)小鼠及给予夹竹桃麻素处理的小鼠均表现出脑梗死范围、4-羟基壬烯酸和丙二醛产物、DNA氧化损伤及中性粒细胞浸润明显减少［33］，表明了Nox2抑制剂具有延迟细胞死亡过程、减少氧自由基生成和脑组织氧化损伤的作用［34］。Chen等［33］为了进一步研究促氧化酶NOX和抗氧化酶SOD1间的相互作用，将SOD1(-/-)小鼠与野生型小鼠进行对此研究，发现局灶脑缺血后SOD1(-/-)小鼠脑内的Nox2增加了1.8～2.8倍，但 SOD1转基因小鼠比野生型小鼠中的Nox2上调并不显著，这表明，NOX的表达受脑组织的氧化还原状态调节，氧化应激有助于脑组织中NOX的表达上调。

NOX蛋白家族中的另一种亚基Nox4也是脑缺血后参与氧化应激反应的主要成员，用Nox4(-/-)小鼠制备大脑中动脉闭塞的脑缺血模型进行研究，发现Nox4(-/-)小鼠与野生型小鼠相比脑梗死范围明显减少，整体神经功能显著改善，表现出具有更好的基础运动功能和协调能力。此外，有研究发现，脑缺血后Nox4(-/-)小鼠脑梗死范围不随时间而增加，提示Nox4基因缺失对脑缺血的保护作用是持续的［35］。显然，这些研究结果均表明，转基因技术的应用使NOX在脑缺血氧化应激中的作用得到了肯定。

5 结语

上述讨论显示，转基因动物在脑缺血氧化应激相关研究中可以发挥重要作用，通过转基因技术，更直接的表达了目标基因在体内脑缺血过程中的作用，并可以显示出目标基因所涉及的相关机制。然而，目前转基因鼠的应用尚有需要解决的问题，需要经过深入研究，使转基因技术在病理药理学研究中发挥更大的作用。

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