悉生蚕的研究与应用

朵建英，王荫槐，魏 强

(中国医学科学院，北京协和医学院，医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021)

悉生蚕的研究与应用

朵建英，王荫槐，魏 强

(中国医学科学院，北京协和医学院，医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021)

悉生蚕是指蚕体内外栖息的其他生物体是已知的蚕，不仅培育方法较哺乳动物简单，且彻底克服蚕的季节性和地域性饲育限制，为蚕在实验动物科学中的广泛应用打下基础。随着现代生物技术的发展，悉生蚕作为生物反应发生器或转基因工程动物的应用已逐步进入实用化研究阶段。

悉生蚕;实验动物;生物反应器;应用

蚕是重要而独特的经济昆虫，至今已被人类驯化利用长达5000余年。家蚕人工饲料饲育［1，2］方法的研究成功，使家蚕的应用摆脱小作坊的生产形式实现工业化生产。悉生蚕的出现更是打开了家蚕作为实验动物进行科学研究、生物材料研制的广阔前景，逐步在生命科学的各个领域发挥不可替代的重要作用。

1 悉生蚕饲育方法的研究

上世纪60年代初，日本科学家率先研发出蚕人工饲料后于1962年饲育成功无菌蚕(germ-free silkworm，简称GF蚕)，后由松原藤好总结创建了独特的松原KIT方式全龄化人工饲料工厂化无菌饲育技术体系［1，3］。随后我国引进该技术，通过消化吸收与创新，在人工饲料无菌养蚕的研究方面取得长足进展［1－4］。但以上养蚕方法中的“无菌”主要是指用于孵化蚕蚁的蚕卵及人工饲料的无菌化处理，其饲育过程虽有在无菌室或无菌箱中进行的，但是为了适应工业化大批量生产的需求，环境空气洁净度并没有达到隔离环境要求的级别，严格来说只能算是已知菌蚕(gnotobiotic silkworm，简称 GN蚕)或无特定病原体蚕(specific pathogen free silkworm，简称 SPF蚕)。

王荫槐等［5］在1999年利用隔离系统首次饲育成功GF蚕，结果显示GF蚕的成活率和结茧率均较普通蚕高，蛹成活率在90%以上，为GF蚕作为实验动物的研究及应用提供了参考。

2 GN蚕作为实验动物的应用

GN蚕的生物背景清楚、饲养与实验操作容易、成本低廉、单批实验成活率高，可一次性提供遗传背景一致的500个左右的实验个体，十分适合作为实验动物进行应用和研究。

2.1 进行蚕病研究

早在100年前巴斯德就通过解剖蚕体发现了蚕病与其体内微生物有关系，并在后来的GF蚕上得到验证。Cappellozza S等利用人工饲料饲育无菌蚕幼虫鉴定出Enterococcus mundtii(蒙氏肠球菌)是蚕软化病的病原体，继之对该细菌的致病机制、感染途径、预防措施等方面进行了研究［6］，研究表明Enterococcus mundtii属于蚕消化道细菌，从消化道感染身体其他组织;通过对卵表面进行消毒可以消除母体垂直传播;饲料中的桑叶粉可能是其传染源，这些研究结果在人类该病原菌的流行病学方面可能起到一定的提示作用。利用GN蚕人们对Bombyx mori nucleopolyhedrovirus(BmNPV，蚕多角体病毒)对蚕的感染机制和特征有了更进一步的了解，发现一种神经诱导的分化相关蛋白BmGDAP1，在病毒感染早期的识别和免疫应答阶段发挥很大作用［7］。

2.2 建立感染模型对致病菌的致病性进行研究

日本研究人员用GN蚕幼虫建立致病菌感染模型研究致病菌对人类的感染机制，观察到金黄色葡萄球菌在幼虫中肠表面的大量增殖，及其在幼虫体液和组织中的存在，并发现大肠杆菌的植入能降低金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和霍乱弧菌对幼虫的致死率［8］。感染不同基因突变型致病菌后的家蚕模型和小鼠模型同样对致病菌的致病基因或毒力决定因子具有筛选作用，致病基因或因子缺失突变的菌株对家蚕的毒性降低［9，10］，通过将突变菌株细胞培养的上清液注射到幼虫血淋巴中，可以对致病菌内外毒素的致死剂量进行定量研究［11］。近年建立的GN蚕模型更是将金黄色葡萄球菌致病因子的研究准确到了细胞壁表面蛋白和各种调节蛋白水平［12］。

2.3 利用感染模型对抗菌药物进行评价

家蚕具有体型小、易操作、实验周期短的特点，用家蚕替代哺乳动物用于新药研发早期阶段药物毒性、有效性及体内吸收分布的研究是可行并有价值的。

在研究恶唑烷酮类药物对金黄色葡萄球菌的抗菌效果时，不同组药物的半数有效剂量(ED50)在家蚕幼虫和啮齿类动物模型中具有相似的趋势［13］。给予家蚕和小鼠相同的细胞毒化合物后，发现化合物在家蚕和小鼠体内致死剂量相似，代谢途径相同，都是与细胞色素P450反应后与羟化物结合，最后排泄［14］，还可以在家蚕饲料中掺入荧光标记化合物，通过观察荧光进一步追踪外源化合物在家蚕体内的吸收和分布［15］，最终证实了家蚕作为候选药物特别是新型抗菌药物早期研发阶段评价模型的可行性。利用新型隐球菌感染蚕模型，成功评价了抗真菌药物两性霉素B、氟胞吡啶、氟康唑和酮康唑对新型隐球菌的治疗效果［16］。

2.4 GN蚕进行生理、毒理学及放射学的研究

蚕作为实验动物在遗传育种、昆虫变态、昆虫激素传递、性别控制等方面已有很多研究。GF蚕的出现扩大和提高了其作为实验动物的应用范围和研究水平。Fujii T等［17］的研究证明性别转录相关因子参与家蚕性信息素偏好的转变，这种因子在昆虫两性性外激素偏好的选择及交配行为发生中起重要作用。增进博之等［18］人以 GF蚕作为实验动物，测定了单一或混合金属引起的蚕的毒性反应、重金属的体内分布、消长及其向蚕后代转移残留金属的分布关系。Kyeong Ryong Lee等［19］人将家蚕血淋巴加入辐射处理后的细胞发现，本应出现上调表达的细胞内质网伴侣蛋白(除irp94)和膜蛋白出现了明显的下调，说明蚕血淋巴中含有一种可以调节ER蛋白在辐射处理后下调表达的因子。

3 GN作为生物反应发生器及其在转基因方面的应用

家蚕生物反应发生器的研究和开发主要以家蚕核型多角体病毒(Bombyxmorinuclear polyhedrosis virus，BmNPV)表达系统为主，以BmNPV为载体，以外源基因替换或部分替代多角体蛋白基因，从而使重组BmNPV在蚕体细胞内大量表达外源蛋白［20］，其表达量高，产物天然性质好［21］。近年来研究较多的蚕丝绢细胞表达系统有其独有的优越性，将外源基因置于丝心蛋白启动子调控下，利用丝腺细胞表达外源基因，外源基因能完整的表达并分泌到丝腺中，表达量高于 BmNPV表达系统十几倍，且目的蛋白纯度高、无需进行繁琐的下游浓缩和提纯处理［22］。

3.1 生产基因工程疫苗

家蚕生物反应器能高水平表达抗原蛋白，且表达产物活性高。Higashihashi等［23］将带乙肝表面抗原的M蛋白基因克隆到转移载体上，再与野生型病毒共转染获得重组病毒，以重组病毒感染家蚕幼虫，可获得高水平表达的 HBsAg，达(400～500)μg/蚕。周耐明等［24］利用重组的BmNPV在家蚕幼虫及蛹中高效表达了具有生理活性的 HBsAg，幼虫表达量为 750 μg/蚕，蛹为 690 μg/蛹，主要表达产物以糖基化形式存在，浮力密度为1.2 g/mL，与病人血清中的HBsAg水平一致。于涟［25］等在家蚕中表达了传染性法氏囊病病毒的主要宿主保护性抗原蛋向Vp2，动物实验表明该蛋白Vp2有良好的免疫原性。构建同时携带3个甲型H1N1流感病毒基因的重组蚕杆状病毒，在蚕体内装配出甲型H1N1流感病毒样颗粒［26］;构建含有犬细小病毒衣壳结构蛋白VP2的重组蚕杆状病毒，在蚕和蚕蛹中表达出保留了VP2特异免疫活性或狂犬病毒特异免疫活性的病毒样颗粒［27］，多种病毒的保护性抗原基因在家蚕BmNPV表达系统中的成功表达，为基因工程病毒亚单位疫苗的研发提供了新的途径。

3.2 表达各种医用蛋白

通过基因融合的方法，将大肠杆菌的asp基因在家蚕杆状病毒中表达，其活性高达5940 U/mg，为利用家蚕生物反应器高效生产该蛋白打下基础［28］。利用Bac-to-Bac表达系统能够获得含有人瘦素蛋白基因及人生长素基因的重组杆状病毒，并且目的蛋白能在家蚕细胞及幼虫体内表达［29，30］。通过构建基于piggyBac的中部丝腺特异表达载体，利用家蚕丝腺生物反应器表达人干扰素－ω(huIFN－ω)，该重组蛋白huIFN－ω具有一定的抗细胞增殖活性［31］。家蚕丝腺生物反应器表达人胰岛样生长因子(hIGF-I)，在G0代转基因家蚕的蚕茧中hIGF-I的表达量约756 ng/g［32］。2004年我国利用家蚕生物反应器生产人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)等生物制品的方法，获得国家技术发明奖。该项目成功构建线性化［33］家蚕杆状病毒载体，以家蚕蛹作为“生物反应器”高效表达人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)等60余种医用蛋白质，建立了家蚕“生物反应器”生物制药的技术平台［34］。使用 GN蚕彻底解决了生物制品生产受季节限制、蚕蛹冷冻保存影响产量、产品易受微生物(包括蚕病病原体)污染［35］等诸多问题，为提高生物制药的质量和产量提供了新的途径。

3.3 改善丝素性能

蚕丝在食品、医药、化工等领域有较广泛的用途［36］。使用基因工程技术，用其他丝素蛋白基因置换或部分置换家蚕丝素蛋白基因或将外源基因置于丝素蛋白基因下游构建的转基因蚕可以突破传统育种的限制，获得具有优良丝质的家蚕新品种［37－39］。此外，通过基因打靶的技术将外源基因导入家蚕得到完全表达外源基因的转基因蚕的思路受到人们的重视。这种技术一旦成熟，人们获得会吐蜘蛛丝［40］、蓖麻蚕丝、樟蚕丝、天蚕丝的转基因家蚕［41］，这些以前产量稀少的材料就不再难以获得了。利用GN蚕代替普通蚕进行“蚕丝”的生产，不但可以实现全年化生产，还可以通过改变GN蚕饲料大大改善“蚕丝”性能，此外，无菌技术的使用还利于转基因蚕的保种和繁殖扩增。

4 GN蚕蚕体各组织器官的作用

家蚕浑身是宝，虽已被人类驯化利用长达5 000余年，但尚远未研究开发殆尽。

4.1 作为轻工业或生物科技原材料

利用GF蚕生产的无菌蚕丝色泽白亮、纤度细而韧度强，并能实现全年工厂化生产，大大推动了蚕丝产业的发展［42，43］。印度柞蚕丝作为心脏组织工程中支架材料的使用已经得到认可［44］，蚕丝中提取的丝胶蛋白已经被作为一种伤口敷料［45］和一种美容剂的添加剂［46］得到使用。

4.2 作为药物或药物添加剂

蚕血淋巴作为药物添加剂的抗衰老作用得到证实［47］，蚕茧提取物具有抗氧化和降血脂的作用，对高血脂和动脉粥样硬化疗效显著［48］。蚕粉能减少糖尿病小鼠小丘脑加压素的产生［49］，可能作为治疗糖尿病，特别是糖尿病神经病变的辅助添加剂。含超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的蚕粉能引起肝癌小鼠自然杀伤细胞(NK cell)活性增强、脾细胞增殖，对肝癌细胞起到显著抑制作用，可以作为一种安全的能激活NK细胞和免疫系统的肿瘤抑制剂［50］。

4.3 作为中药材的使用

蚕衣、僵蚕、僵蛹、蚕沙和蛹虫草等作为传统中药材使用时，既没有药材标准，更没有良好的生产环境，产品质量没有保证。如果用GF蚕来生产蚕衣、僵蚕、僵蛹、蚕沙和蛹虫草，可有效控制杂菌的污染，提高中药材生产质量，保证用药安全有效。

冬虫夏草是我国十分名贵的中药材，人工栽培的蛹虫草或北虫草与其在营养元素、有效物质成分等方面很相似［51，52］，虽然可在一定程度上代替稀有的冬虫夏草作为药品或保健品进行使用，但其不具备药材学上完整的“虫草”外形特征，由于“虫”的缺失，一方面可能导致“草”生长过程中与宿主相互作用产生的某些物质，如抗体等的缺失，另一方面也是导致虫草无性培育时菌株质量连年下降的重要原因之一。

利用GF蚕幼虫代替蝙蝠蛾幼虫接种虫草菌进行冬虫夏草的人工培育可以为人们提供一个深入研究冬虫夏草形成、培育与有效物质药理活性的良好素材。冬虫夏草是一种真菌与昆虫的结合体，虫体感染过程中是否有其他真菌的参与，各种菌所起的作用是什么，在什么时期起作用等问题还尚不明了，GF蚕幼虫感染虫草菌模型能很好的解决这一问题。同时，GF蚕虫草的培育成功还可以为高纯度虫草菌的分离纯化，及高质量、无污染虫草产品的获得提供可靠的途径。

5 小结与展望

GN蚕排除了其他微生物对宿主的影响，为蚕病致病菌致病机制的研究提供了良好的实验动物，同时使用GN蚕作为实验动物可一次获得500个左右遗传背景一致的实验个体，且体型小、便于操作、成本低廉、容易分离器官和血淋巴，荧光化合物的使用证实了化合物在蚕体和小鼠体内代谢途径的一致性，这些特点使GN蚕替代哺乳动物作为新药研发早期阶段，特别是合成化合物量很少的情况下，评价化合物毒性、治疗效果的有效模型提供了可行性。

蚕生物反应器有基因工程产品“微型发酵罐”之称，GN蚕BmNPV表达系统的构建不但能有效提高外源蛋白产量，还能从根本上改善外源蛋白的质量，彻底解决产物，特别是基因工程口服药物的微生物污染问题。蚕丝绢体细胞表达系统目的蛋白产量高、产物无需进行繁琐的下游浓缩和提纯处理［53］，具有很大的开发前景，如果将转基因后的蚕卵进行人工无菌饲育，其丝绢体表达系统的遗传性状不变，但丝素性质应该会得到很大改善。

GF蚕体内外无微生物，整个生长过程无污染的特点使其作为中、西药材料，保健品、药品添加剂甚至是食品时具有普通家蚕无可比拟的优越性。传统中医学对蚕体的应用没有药材标准，GF蚕作为中药原料可提高药材质量，保证用药安全。随着人们对家蚕研究的深入，丝蛋白、丝胶蛋白越来越多的潜在价值被发掘出来，最近的研究表明，丝胶蛋白能加速乙醇通过尿的排除和在肝中的氧化作用，丝胶蛋白的水解产物还能诱导胰岛中β细胞的活性而增加胰岛素的分泌［54］，预示丝蛋白是一种生物调节因子，可能在解酒剂、糖尿病药物的研发方面发挥新的作用。通过对丝蛋白在提高免疫力方面作用的研究，证实其能作为一种食品中的免疫增强添加剂得到开发。运用GF蚕可以生产出无抗生素、微生物污染的丝蛋白、丝胶蛋白产品，更能简化提取工艺，提高生产效率、节约成本。

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Research and Application of Gnotobiotic Silkworm

DUO Jian-ying，WANG Yin-huai，WEI Qiang
(Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health;Institute of Medical Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences;Key Laboratory of Human Diseases Animal Models，State Administration of Traditional Chinese Medicine;Peking Union Medical College，Beijing 100021，China)

The silkworm with no unknown organisms living in or outside its body called gnotobiotic silikworm.The foster methods of gnotobiotic silikworm is much easier then that of mammal ones，and completely overcomed seasonal and regional breeding limits.Gnotobiotic silikworm lay the foundation for its wide application in laboratory animal science.With the development of modern biotechnology，study on the application of gnotobiotic silikworm as a bioreactor generator or genetic engineering animal has been gradually developed into the practical stage.

Gnotobiotic silkworm;Laboratory animal;Bioreactor generator;Application

R33

A

1671-7856(2012)08-0068-06

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.008.016

2012-06-05

科技重大专项－艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治，项目号2012ZX10004－501。

朵建英(1984－)，女，硕士，技师，从事悉生动物研究工作。

魏强，男，教授，博士导师，研究方向:实验动物病毒学。E-mail:weiqiang0430@sohu.com。