猪链球菌2型毒力相关因子及保护性抗原研究进展＊

何永聚，祝令伟，冯书章

猪链球菌是在世界范围内传播的一个重要的人兽共患病原体，可引起猪的脑脊膜炎、肺炎、心内膜炎、败血病、关节炎等症状。在已分离的猪链球菌35个血清型中，猪链球菌2型（SS2）流行范围最广。1998年和2005年在中国江苏省与四川省暴发了人感染SS2的疫情，分别引起14人和38人死亡［1］。目前已有报道超过700人感染SS2的病例，且主要集中在东南亚［2］。因此SS2严重危害着公共卫生安全，已引起了科研人员及公众的广泛关注。

目前已经发现了许多SS2典型的毒力因子，其中荚膜多糖是最早被发现的主要的毒力因子［3］，之后其它一些毒力因子如溶血素、胞外蛋白因子、溶菌酶释放蛋白、黏附素等也相继被发现。然而研究发现，一些强毒菌株缺失掉这些毒力因子后，SS2仍有毒力，在一些无毒或弱毒菌株中也能检测到这些毒力因子的存在，因此认为SS2可能还存在着结构与功能未知的毒力因子。以下对近几年新发现的毒力相关因子和保护性抗原进行论述。

1 调节因子

调节因子是在细菌基因表达调控中，在各种刺激信号的影响下通过信号传导能直接或间接地识别或结合在各顺式作用元件的序列上，参与调控靶基因转录效率的因子，分正调控和负调控。这些因子虽不直接表达毒力蛋白，但大多能调节细菌在体内的生存、对环境的耐受以及毒力因子的表达，是细菌重要的毒力相关因子，也是疫苗研究和新型抗菌药物研究的重要靶点。

1．1 调节因子luxS luxS因子被报道在调节细菌各种活动和种间传播方面发挥显著作用。在Wang Y等［4］的研究中，他们构建了SS2基因缺失菌株△luxS，与野生株相比，突变株溶血活力明显降低，对HEp－2细胞的黏附也降低了51%。通过实时定量PCR显示，已知的毒力因子如gdh、cps、mrp、gapdh、sly、fbps和ef 等在体内的表达分别降低0．66、0．61、0．45、0．48、0．29、0．57 和0．38。在感染斑马鱼动物模型的实验中，△luxS的半数致死剂量显著升高。这些实验结果表明，luxS的缺失，使细菌的溶血活力、对细胞的粘附力及一些重要毒力因子的转录水平发生了变化。luxS因子因能干扰细菌的信号传输，对细菌毒力因子的表达有重要作用。

1．2 二元信号调节系统CiaRH 二元信号调节系统（Two－component regulatory systems，TCS）是致病菌中普遍存在的一种跨膜信号转导机制，在调节毒力基因的表达中有重要作用。Li J等［5］构建了TCSCiaRH基因敲除突变株，并研究突变株与野生株比较在体内与体外毒力变化情况，突变株对Hep－2和PIEC上皮细胞的粘附力显著减弱，CiaRH缺失使巨噬细胞对SS2的吞噬力增加，也提高了SS2在体内血液中的清除率，CD1小鼠与猪的体内感染实验也表明细菌致病力减弱。这些结果表明，CiaRH对猪链球菌2型的毒力也是必需的。

1．3 正向调节因子AdcR和Fur 锌和铁是细菌中一些蛋白的重要组分，在链球菌中AdcR和Fur控制着锌和铁的运输。在Aranda J等［6］的研究中，利用鼠模型测定SS2△AdcR和△Fur缺失株的毒力变化。结果显示，△AdcR和△Fur缺失株与野生型亲本株比较，毒力显著减弱，并且所有缺失菌株对氧化应激反应更加敏感。他们的数据证明AdcR和Fur基因在SS2氧化应激反应与SS2的全毒力中发挥着重要作用。

1．4 触发因子（Trigger factor） Wu T 等［7］在研究中，阐明了触发因子与细菌耐受应激与毒力的关系，并构建了SS2的SC21菌株tig全基因缺失菌株（△tig）和恢复互补菌株（C△tig），实验证明，缺失菌株对HEp－2细胞的粘附力显著减弱、溶血能力下降，并对热、氧化、酸等应激耐受力下降，通过实时定量PCR显示tig基因对已知的SS2的主要毒力因子，如cps、sly、mrp 等有显著影响，同时△tig 的LD50也显著降低。这些都指明触发因子在SS2感染的发病机制和应激耐受方面发挥重要作用。

1．5 转录调控因子Rgg 王忠胜等［8］构建了SS2强毒株05ZYH33调控因子Rgg的突变株，用基因芯片的方法分析野生株与缺失株的基因表达差异，并在突变株中发现了45个基因表达变化较大的基因，其中19个表达上调，26个表达下调。这些基因在细菌毒力、免疫抗原、DNA合成和修复、基础代谢和ABC转运系统等方面起着重要作用，说明Rgg是一个全局调控因子。

2 表面蛋白

细菌的表面元件，尤其是表面蛋白，由于和外界环境直接接触，与病原菌的生存能力和致病性等密切相关。表面蛋白大多在细菌对细胞的黏附、血液的侵袭、凝血过程、免疫逃避以及营养物质跨膜递送等多方面发挥关键作用，是多种病原菌感染宿主的必要环节［9］。SS2等革兰氏阳性菌表面蛋白要锚定在细菌细胞壁上，需要分选酶的切割并在分选酶的催化下与肽聚糖共价键结合。表面蛋白一般是重要的毒力因子或具有良好的免疫原性的保护性蛋白。2．1 分选酶Srt（Sortase） 革兰氏阳性细菌表面蛋白和菌毛要锚定在细胞壁上需要分选酶（sortase，Srt）的催化参与。在SS2基因组中已知有6个与 Srt同源性的蛋白 （srtA、srtB、srtC、srtD、srtE、srtF），其中srtB、srtC、srtD 是一个簇。srtA是管家分选酶，负责所有含“LPXTG”基序的表面蛋白的催化和锚定。陈红娜等［10］利用基因重组原理构建了srtBCD缺失的突变株，体外实验结果显示srtBCD缺失后细菌的生长速率减慢，与Hep－2上皮细胞的粘附率明显降低，小鼠毒力实验数据表明突变株毒力无明显变化。实验证明SS2的srtBCD基因与细菌的黏附能力有重要关系。陈红娜等［11］还构建了05ZYH33srtF同源突变体，突变菌株与野生菌株在菌落形态、生长速率及对小鼠的致病力上均无显著差异，但在小鼠竞争实验中发现，突变株在心脏的定殖及感染能力上显著减弱。

2．2 菌毛亚单位（pilus subunit） 细菌的菌毛是细菌比较关键的毒力因子，其菌毛亚单位也看作极好的疫苗候选者，但是菌毛成分在SS2中的功能性作用和免疫保护潜力还未被研究。Garibaldi M等［12］使用蛋白组学方法，发现了一个SS2表面蛋白，经生物信息学分析、免疫印迹及免疫荧光检测显示是细菌的菌毛亚单位辅基，用小鼠模型做重组菌毛亚单位蛋白的免疫保护性实验，结果表明对小鼠SS2的感染有显著的保护作用。秦跃红等［13］构建了SS2中国强毒株05ZYH33菌毛骨架蛋白编码基因SSU2101敲除突变株，生物学特性和小鼠致病性试验显示：虽然突变株的菌落形态、溶血活性以及染色特性方面与野生株之间均无明显差异，但突变株的毒力比野生株显著减弱。研究结果也提示菌毛在SS2感染致病过程中起重要作用。

2．3 保护性抗原HP0197 HP0197是一种新的已被确定的具有免疫原性的蛋白，在C端具有典型分选信号“LPXTG”，与已知的蛋白没有任何同源性。Zhang A［14］等发现HP0197是一种新的表面保护性抗原，并对其保护性进行了鉴定，在猪和小鼠模型内研究了它的保护效力，并做了体外细胞试验和被动免疫试验。证明HP0197具有很好的保护效力，这个蛋白也被认为很可能成为新型疫苗的候选者。

2．4 保护性抗原 HP0272 Chen B等［15］发现了一个新的具有免疫原性的表面蛋白HP0272，用纯化的HP0272免疫小鼠模型，能诱发显著的体液免疫反应，有很高的抗体滴度，对致死剂量的SS2感染具有完全的保护作用。实时定量PCR发现HP0272在几乎所有的SS2菌株和半数其他型的参照菌株中存在，可以作为新型疫苗的候选者。

2．5 6－磷酸葡萄糖脱氢酶（6－phosphogluconate－dehyrogenase） 6－磷酸葡萄糖脱氢酶是与戊糖磷酸循环有关的酶，它催化6－磷酸葡萄糖氧化脱羧成5－磷酸核糖，同时释放NADP，NADP认为是NADPH的主要来源。Tan C［16］等对6－磷酸葡萄糖脱氢酶基因进行克隆表达，并证明6－磷酸葡萄糖脱氢酶是一种细胞壁表面蛋白，在小鼠模型中进行试验，证明6－磷酸葡萄糖脱氢酶具有粘附素的作用，在hep－2及hela竞争抑制性细胞试验中，6－磷酸葡萄糖脱氢酶竞争性干扰SS2对这两种细胞的粘附，干扰率分别为72%和66%。在动物保护性实验中，对CD－1小鼠内的保护效率达80%，是一种较好的保护性细胞表面抗原。

2．6 类枯草杆菌丝氨酸蛋白酶SspA（subtilisinlike serine protease） Bonifait L等［17］证实 SS2中的SspA与在其它致病性链球菌中的功能一样，在SS2的感染过程中发挥重要作用。Hu Q等［18］研究发现在SS2发病机制中SspA位于细菌表面，分别进行体内与体外表达发现，体内表达远远高于体外表达，SspA蛋白约170kDa，具有生化活性，与其他微生物产生的枯草杆菌蛋白酶相似。它具有很高的蛋白酶水解活性，同时能够水解纤维蛋白原Aa链，因此可以抑制有凝血酶介导的纤维蛋白的生成。SspA在SS2感染机制中发挥着重要作用，敲除这个基因的突变株与野生菌株相比毒力明显减弱，在感染动物体内能够促进抗体的产生，证明SspA与SS2毒力有关。

2．7 lgA1蛋白酶 致病菌的lgA1蛋白酶有助于细菌侵入机体的黏膜免疫系统。Zhang A等［19］研究发现，当iga基因缺失时，SS2的侵袭力明显减弱。因此推断，在侵入宿主的黏膜免疫系统时，分泌性的lgA1蛋白酶发挥着重要作用。另外，感染实验表明，敲除iga基因的菌株导致该致病菌的致死率下降。实验研究也表明lgA1蛋白酶可能是猪链球菌的毒力因子之一，在SS2的致病机制中起一定作用。

2．8 HtpS（histidine triad protein of Streptococcus suis）蛋白 三联组氨酸蛋白属于一个与猪链球菌表面相关的蛋白家族，该家族包含来自肺炎链球菌和化脓性链球菌的PhtA、PhtB、PhtD、PhtE、HtpA 5个成员，它们也被证实可作为宿主感染的保护性抗原。Shao Z等［20］研究发现在 SS2的05ZYH33菌株中有一段与HtpA、PhtD高度同源的基因序列，并命名为HtpS。他们发现HtpS在SS2高度保守并在猪链球菌35个血清型中广泛存在（29／35）。在SS2感染中表达的HtpS蛋白经免疫印迹和流式细胞仪验证属于细胞表面相关蛋白。抗HtpS蛋白血清能增加人体内补体3的沉积并能降低SS2在血液中的溶血效应。经重组蛋白HtpS免疫后的小鼠能显著增加它们在SS2感染后的存活率。

3 其它毒力相关因子

3．1 Trag（transfer gene G）基因 Trag基因是利用体内诱导抗原技术 IVI－AT （in vivo－induced antigen technology）通量筛选鉴定的猪链球菌2型的致病相关因子，Trag参与细菌的分泌途径，是IV型分泌系统（type IV secretion system，TFSS）的组成成分，Trag基因在细菌感染过程中可能参与毒力因子的转移、毒力蛋白的分泌，使宿主菌产生相应的酶或毒素，导致毒力增强。祝昊丹［21］等检测1998年江苏及2005年四川流行株和其它临床分离株中的Trag基因分布结果显示，SS2、SS7中几乎都有Trag基因的存在，SS9中大部分含有Trag，但是非毒力菌株SS1、SS1／2和兰氏C群猪源链球菌中没有Trag基因，这表明Trag基因可能与猪链球菌的毒力有关。

3．2 lin0523基因 李鹏等［22］利用温敏穿梭自杀质粒pSET4s，定点敲除SS2野生型强毒株ZY458的lin0523基因，构建基因缺失突变菌株458Δlin，利用家兔感染模型对ZY458及其突变菌株的生物学特性进行比较研究。接种ZY458感染组家兔5／5死亡，458Δlin（plin）感染组家兔 4／5 死亡。而458Δlin感染组家兔生长正常，未出现任何明显临床症状，证实lin0523基因与猪链球菌2型的毒力密切相关。

3．3 SSGI4基因岛 祝令伟等［23］通过比较猪链球菌2型强毒株与弱毒株和无毒株的基因组差异，发现一个只存在于强毒株，而在弱毒或无毒菌株中没有的基因岛，并命名为SSGI4。该基因岛全长11 269bp，包含11个编码基因，部分基因推测为可能的膜表面蛋白基因或氨基酸结合蛋白基因。新发现的基因岛SSGI4具有致病性基因岛的各项典型特征，可能与猪链球菌2型强毒株的致病性有关。

3．4 AI1（angiogenin inhibitor 1） 透明质酸酶（hyaluronidase，HAase）是能使透明质酸产生低分子化作用酶的总称，它在SS2感染过程中能够降低体内透明质酸的活性，从而提高SS2在组织中液体渗透能力［24］。Tao Wu等［25］发现了1个与SS2透明质酸酶有关的新型血管生成素抑制因子AI1，血管生成素抑制因子是1种核糖核酸酶。应用酵母双杂交系统显示AI1与酵母中的透明质酸酶有关系，免疫共沉淀分析也证明AI1与透明质酸酶有关系。并且在正常细胞和SS2感染的细胞中都发现了所筛选的CDNA的转录和翻译，且这些过程主要集中于293T细胞的细胞质中。这些结果表明AI1可能通过干扰SS2中透明质酸酶影响SS2感染的发病机制。

3．5 异柠檬酸脱氢酶IDH（isocitrate dehydrogenase） 异柠檬酸脱氢酶是柠檬酸循环过程中的关键酶，这个酶可以催化柠檬酸化合物经氧化脱羧作用生成α－酮戊二酸和NAD（P）H，在细菌的生存中不可缺少。Wang P等［26］过表达并研究了了SS2强毒株05ZYH33中的IDH，IDH大小约为74kDa，并且发现在SS2中，阳性Mg2＋是对IDH影响最大的二价离子。IDH优化最合适的pH分别是 Mn2＋7．0、Mg2＋8．5，温度分别是 Mn2＋30℃、Mg2＋50℃活力最高。在SS2中IDH对NAD＋是一个重要的辅酶，Wang P等研究认为IDH是SS2生存中重要的代谢酶，并期望IDH作为SS2感染检测和血清学诊断的重要因子。

综上所述，虽然已经发现了很多SS2的毒力因子，但SS2如何在动物体内传播和感染，其主要的毒力因子是如何发挥作用的仍然所知有限。对已验证的、具有免疫保护作用的SS2强毒株主要毒力因子荚膜多糖（cps）的争论也很多，因为很多无毒菌株也是有荚膜的。除cps外，很多可能的主要毒力因子也不是仅存在于猪链球菌强毒株中的，在弱毒或无毒菌株中它们都可以被发现。一些强毒菌株的毒力因子被敲除后，在多数情况下，它们的毒力会丧失或下降，这可能是因为SS2的致病机理是多因子共同协作的结果，毒力因子之间的关系可能是互补的，1个因子的缺失导致整个菌株毒力的丧失或下降。所以对SS2的致病机理及毒力因子等方面的研究意义重大，还需广大科研工作者进一步探索。

［1］Lun ZR，Wang QP，Chen XG，et al．Streptococcus suis：an emerging zoonotic pathogen［J］．Lancet Infect Dis，2007，7（3）：201－209．

［2］Wertheim HF，Nghia HD，Taylor W，et al．Streptococcus suis：an emerging human pathogen［J］．Clin Infect Dis，2009，48（5）：617－625．

［3］Chabot－Roy G，Willson P，Segura M，et al．Phagocytosis and killing of Streptococcus suis by porcine neutrophils［J］．Microb Pathog，2006，41（1）：21－32．

［4］Wang Y，Zhang W，Wu Z，et al．Functional analysis of luxS in Streptococcus suis reveals a key role in biofilm formation and virulence［J］．Vet Microbiol，2011，152（1／2）：151－160．

［5］Li J，Tan C，Zhou Y，et al．The two－component regulatory system CiaRH contributes to the virulence of Streptococcus suis 2［J］．Vet Microbiol，2011，148（1）：99－104．

［6］Aranda J，Garrido ME，Fittipaldi N，et al．The cation－uptake regulators AdcR and Fur are necessary for full virulence of Streptococcus suis［J］．Vet Microbiol，2010，144（1／2）：246－249．

［7］Wu T，Zhao Z，Zhang L，et al．Trigger factor of Streptococcus suis is involved in stress tolerance and virulence［J］．Microb Pathog，2011，51（1／2）：69－76．

［8］王忠胜，曾小涛，袁媛，等．猪链球菌2型强毒株05ZYH33转录调控因子Rgg基因敲除突变体与野生株的基因表达差异分析［J］．生物技术通讯，2010，21（6）：812－817．

［9］祝令伟，郭学军，冯书章．革兰氏阳性细菌分选酶功能和应用研究进展［J］．中国人兽共患病学报，2010，26（10）：966－969．

［10］陈红娜，廖辉，王长军，等．猪链球菌2型分选酶srtBCD基因敲除株的构建及其生物学特性分析［J］．微生物学通报，2011，51（3）：386－392．

［11］陈红娜，王长军，潘秀珍，等．猪链球菌2型srtF基因敲除突变株的构 建 及 其 毒 力 ［J］．微 生 物 学 通 报，2010，37（12）：1786－1792．

［12］Garibaldi M，Rodriguez－Ortega MJ，Mandanici F，et al．Immunoprotective activities of a Streptococcus suis pilus subunit in murine models of infection［J］．Vaccine，2010，28（20）：3609－3616．

［13］秦跃红，王长军，陈红娜，等．猪链球菌2型菌毛骨架蛋白编码基因SSU2101敲除突变株的构建及其生物学功能［J］．微生物学通报，2010，37（8）：1176－1181．

［14］Zhang A，Chen B，Li R，et al．Identification of a surface protective antigen，HP0197of Streptococcus suis serotype 2［J］．Vaccine，2009，27（38）：5209－5213．

［15］Chen B，Zhang AD，Li R，et al．Evaluation of the protective efficacy of a newly identified immunogenic protein，HP0272，of Streptococcus suis［J］．Fems Microbiology Letters，2010，307（1）：12－18．

［16］Tan C，Fu S，Liu M，et al．Cloning，expression and characterization of a cell wall surface protein，6－phosphogluconate－dehydrogenase，of Streptococcus suis serotype 2［J］．Vet Microbiol，2008，130（3／4）：363－370．

［17］Bonifait L，Vaillancourt K，Gottschalk M，et al．Purification and characterization of the subtilisin－like protease of Streptococcus suis that contributes to its virulence［J］．Vet Microbiol，2011，148（2／4）：333－340．

［18］Hu QY，Liu P，Yu ZJ，et al．Identification of a cell wall－associated subtilisin－like serine protease involved in the pathogenesis of Streptococcus suis serotype 2［J］．Microbial Pathogenesis，2010，48（3／4）：103－109．

［19］Zhang A，Mu X，Chen B，et al．IgA1protease contributes to the virulence of Streptococcus suis［J］．Vet Microbiol，2011，148（2／4）：436－439．

［20］Shao Z，Pan X，Li X，et al．HtpS，a novel immunogenic cell surface－exposed protein of Streptococcus suis，confers protection in mice［J］．Fems Microbiology Letters，2011，314（2）：174－182．

［21］祝昊丹，顾宏伟，陆承平．体内表达新基因trag在猪链球菌的分布及其免疫反应性分析［J］．微生物学通报，2008，48（12）：164－168．

［22］Li P，Liu J，Zhu L，et al．VirA：a virulence－related gene of Streptococcus suis serotype 2［J］．Microb Pathog，2010，49（5）：305－310．

［23］祝令伟，蔡雪辉，刘军，等．猪链球菌2型新基因岛SSGI4的发现［J］．中国人兽共患病学报，2009，25（7）：615－618．

［24］Allen AG，Lindsay H，Seilly D，et al．Identification and characterisation of hyaluronate lyase fromStreptococcus suis［J］．Microb Pathog，2004，36（6）：327－335．

［25］Wu T，Yuan F，Chang H，et al．Identification of a novel angiogenin inhibitor 1and its association with hyaluronidase of Streptococcus suis serotype 2［J］．Microb Pathog，2010，49（1／2）：32－37．

［26］Wang P，Jin M，Su R，et al．Enzymatic characterization of isocitrate dehydrogenase from an emerging zoonotic pathogen Streptococcus suis［J］．Biochimie，2011，93（9）：1470－1475．