涂片染色法在精液白细胞检验中的应用

马晓慧 车小新*

（1 河南省人民医院检验科，河南 郑州 450003；2 河南省人民医院皮肤科，河南 郑州 450003）

人精液中白细胞计数的传统方法是用组织化学方法鉴定多形核粒细胞特有的过氧化物酶，虽然这种技术有相对易于操作的长处，但它不能检测已经活化并已释放其颗粒的多形核白细胞，也不能检测不含过氧化物酶的其他种类的白细胞[1]。例如淋巴细胞。这类细胞通过免疫细胞化学方法进行检测。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本组患者选自笔者所在医院门诊及住院患者50例，30～35岁9例，36岁～40岁29例，41岁-45例12例。实验室进行精液常规检查的患者。在直接涂片检验，高倍镜下判定为“白细胞”，其数量＜10/HP，精子精量＜50×109/L的对其同时进行涂片染色检验。

1.2 方法

正甲苯胺过氧化物酶染色：试剂应用饱和NH4CI溶液（ 250g/L），50g/L Na2EDTA磷酸缓冲液（pH 6.0），正甲苯胺（0.25mg/mL），30%H2O2蒸馏水溶液。此工作液含：1mL试剂1；lmL试剂2；9mL 试剂3；和一滴试剂此溶液配制后可使用24小时。试验步骤将0.lmL精液与0.9mL工作液混合，振荡2分钟，在室温下放置20～30min，再振荡，过氧化物酶阳性细胞被染成棕色，而过氧化物酶陇性细胞不着色，用白细胞计数池重复计数200个白细胞两次，并估计过氧化物酶阳性和阴性细胞的百分比。

2 结 果

共检验出疑似“白细胞”标本50份，采用正甲苯胺过氧化物酶染色检查后，仅发现10份标本系白细胞。其中5份仅检出白细胞，5份标本同时还检出各级生精细胞，其数量各约占50%。有18份标本只发现个别白细胞，绝大部分细胞系为各级生精细胞。余22份标本只发现各级精母细胞而未发现白细胞。

3 讨 论

精子中最主要的结构为一浓集的细胞核，携带遗传物质即DNA，成熟的精子中胞浆少，既无核RNA又无浆RNA。既不生长，也不分裂仅含单倍体量的DNA。从一个双倍体精原细胞发育为近百个单倍体精子需增加几十倍的DNA。用放射自显影术证明这些DNA均在精子细胞有丝分裂过程中合成，细线期初级精母细胞后不再有DNA合成。初级精母细胞中含四倍量DNA，经两次成熟分裂到精子细胞期即成为单倍体细胞。也曾用放射自显影术研究RNA代谢，精原细胞和精母细胞均有RNA代谢，精子细胞早期有低水平RNA合成，中期精子细胞后就不再合成[2]。精原细胞和精母细胞均可合成核仁RNA及非核仁RNA。细线期与偶线期精母细胞中核仁RNA合成达高峰值，而非核仁RNA合成高峰在粗线期精母细胞。

试验发现葡萄搪对精子发生过程中的蛋白质合成系统有保护作用。体外的氨基酸掺入试验证明，加入葡萄糖后各级生精细胞中氨基酸掺入均增加。粗线期初级精母细胞的掺入量最多，早期精子细胞掺入量增加的幅度最大。葡萄糖还能大大减轻温度对睾丸蛋白质合成的破坏作用。目前来看，葡萄糖供应对精子细胞的变态过程及其蛋白质合成系统十分重要，而精原细胞及初级精母细胞的蛋白质合成对葡萄糖的依赖就不强。故FSH起一始动作用，发动以后单独靠睾酮也可维持一定生精功能。三种激素均不能直接作用于生精细胞，都直接或间接作用于支持细胞，然后进一步创造适合精子发生的内环境。已在支持细胞表面证实有FSH受体，FSH并不能通过血睾屏障;在支持细胞内也证实有雄激素受体[3]。雄激素也可作用于曲细精管壁周围的类肌细胞。大多数学者认为ICSH主要促进间质细胞分泌雄激素，然后刺激精子发生，这些均提示支持细胞在精子发生的调控中占特殊地位。又发现支持细胞还可调节间质细胞合成与分泌睾丸酮。体外培养的支持细胞可分泌一种促进间质细胞分泌睾丸酮的因子，同时支持细胞可分泌雌激素及LHRH样物质，这两个激素却是间质细胞功能的抑制因子。支持细胞与间质细胞间也有复杂的功能关系。

睾网液内的精子有活动能力，一旦进入附睾头段后即失活力。精子在附睾运行过程中运动方式有规则性的改变，先出现原地摆动，然后转圈状运动，最后才有螺旋式的向前运动。所以观察精子的运动方式是衡量精子成熟的一个指标。精子成熟过程中细胞内cAMP增加与精子动力获得密切相关。使用磷酸二酯酶可使未成熟精子内cAMP含量升高并产生一定运动能力，但并无前向运动。研究证实附睾头部磷酸二酯酶的活性为附睾尾的两倍，这可能是精子成熟过程中cAMP升高的原因。附睾上皮还可产生一特异的前向运动蛋白，这种糖蛋白与附睾精子结合时可促进其产生前向运动[4]。另外Ca2+也是调节精子运动的重要因素。

精子发生过程中，其核中发生组蛋白型的转变。精子在附睾内运行过程中精子核中DNA与鱼精蛋白紧密结合，故表现为精子成熟过程中精子核的DNA细胞化学染色（如Fculgen）不断减弱，这也是精子是否成熟的重要指标。精子成熟过程中最重要的结构改变是蛋白质结合硫基减少，而二硫键增加。这种改变可见于精子核、顶体下区、顶体后区、精子中段、鞭毛纤维鞘、精子膜。如此广泛的转换与精子结构的稳定密切相关。

精子成熟过程中磷脂、脂肪酸及硫基等的改变均意味膜结构的改变。附睾分泌一些物质附着精子表面使精子结构与性质明显改变。精子膜在受精过程中起关键作用，这表明精子成熟过程中其膜结构已成熟到能完成受精作用的地步；但另一方面附睾精子要在射出以后转运到输卵管时才真正发生受精作用，故附睾精子膜在成熟的同时还将覆盖上一些物质使之暂时不起作用。总之精子成熟过程中膜有两方面改变，一是为受精做好准备，另一是暂时阻抑其受精功能。精子在阴道内不会获能，若宫颈口开放则可使精子获能。子宫是精子获能的主要场所，输卵管分泌液卵泡液及卵丘也参与获能，精子只有与子宫内膜接触才能获能。分析家兔子宫及输卵管中的淀粉酶均高于血清水平几倍，淀粉酶也随性周期改变，以排卵期最高。另精子在宫腔内有大量白细胞出现，白细胞一进人宫腔，精子即与其附着，白细胞中的糖原分解成葡萄糖供精子能量需要，另自细胞特殊颗粒释放水解酶以去除精子表面的去能因子未完成获能的第一步反应。

卵母细胞外有一层糖蛋白构成的透明带，透明带外是富含粘多糖的卵丘与放射冠，精子要同时消化粘多糖和蛋白质才能与卵结合。顶体酶系中有一些特殊的酶，透明质酸酶可消化卵丘细胞，放射冠分散酶可使放射冠解体，顶体蛋白酶使精子穿过透明带。透明质酸酶最适pH是3.8，此酶的活性有赖于钠、钾浓度，hCG诱发排卵后的子宫液能促进其释放，孕酮及切除卵巢后的子宫液则抑制其活性。放射冠分散酶是一脂糖蛋白，只作用于放射冠不影响透明带。顶体蛋白酶是一大类蛋白酶，可使透明带分解，又称为类胰蛋白酶。人精子中顶体蛋白酶可被宫颈粘液中的抗胰蛋白酶抑制剂及抗凝血酶所抑制，此三种物质在排卵期的宫颈粘液中均减少。顶体蛋白酶具氨基肽酶、酯酶及蛋白酶活性，对精氨酸键有高度选择作用。顶体中还有唾液酸酶，是与顶体结合最紧的酶。一般认为它可改变透明带的结构，不让其他精子再穿过。

[1]党小军,胡淑玲,李芒会.流式细胞术在白细胞精子症精子质量评估中的应用[J].现代检验医学杂志,2011,26(3):45-46.

[2]李如凯,郭龙华.C14orf48基因在人精液精子中的表达和生物信息学分析[J].中国实验诊断学,2011,15(6):23-24.

[3]李雪兰,钟晓敏.尿液中含有精子对检测结果的影响[J].检验医学与临床,2011,13(6):65-66.

[4]黎兴盛,鲍琳,杨春,等.216例男性不育症精液检验与血清中抗精子抗体的关系[J].实验与检验医学,2011,29(2):99-100.