酶法提取桑葚多糖的工艺研究

刘晓露，刘胜利，郭立强，黄礼徳，黄锁义

(右江民族医学院，广西 百色533000)

桑葚为桑科植物桑(Morus alba L).的干燥果穗。具有滋阴补血，生津润燥。用于肝肾阴虚，眩晕耳鸣，心悸失眠，须发早白，津伤口渴，内热消渴，肠燥便秘［1］。目前，关于桑葚多糖药理作用已有报道，李颖、李庆典通过桑葚多糖对羟基自由基和超氧负离子自由基的清除作用，评价桑葚多糖的抗氧化活性，表明桑葚多糖能够清除自由基，阻断自由基反应链，具有一定的抗氧化及防衰老作用［2］。廖森泰等通过对糖尿病小鼠进行降血糖治疗试验，显示桑葚多糖有显著的降血糖作用［3］。但关于桑葚多糖的提取分离工艺报道较少，多采用大孔吸附树脂提取纯化桑葚多糖［4］，其工艺复杂，耗时较长，不利于工业生产。近年来，酶法作为一种提取生物活性成分的新技术的报道日益增多［5－6］，其方法高效简单。本实验采用纤维素酶解法提取桑葚多糖，旨在筛选纤维素酶法提取桑葚中多糖的工艺条件。

1 仪器与试药

1.1 仪器

电子分析天平FA1104(上海天平仪器厂)、电热恒温鼓风干燥箱(上海及精密实验设备有限公司)、植物粉碎机FZ102(上海锐丰仪器仪表有限公司)、KQ5200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、电热式恒温水浴锅HHS－21－4(江苏金坛宏凯仪器厂)、SHB－III循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)、80－2离心沉淀器(江苏省金坛市医疗仪器厂)、722N可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。

1.2 试药

纤维素酶(活力40 000 U/g)(天津利华酶制剂有限公司)、桑葚(购自广西百色市右江区)、葡萄糖对照品(广东汕头市西陇化工厂)、其他所用试剂均为分析纯。

2 试验方法与结果分析

2.1 桑葚多糖的提取［7］

纤维素酶悬浮液的制备:精密称取纤维素酶1.25 g，用蒸馏水定容至500 mL放入冰箱待用，用前摇匀。

酶法提取:取1.0 g桑葚加缓冲溶液及不同体积的酶悬浮液，缓冲液及酶悬浮液的总体积为50 mL，于不同温度在水浴振荡器中反应一定时间，沸水浴中灭活5.0 min，过滤，离心。

2.2 桑葚多糖的测定

本实验对多糖的测定采用硫酸—苯酚法［5］。取待测液1 mL置于10 mL的试管中，加入5%的苯酚溶液1.0 mL，混匀，迅速加入5.0 mL的浓硫酸，摇匀，40℃水浴中反应30 min，然后置于冷水中冷却10 min，以葡萄糖为标样，于波长490 nm处测定吸光度值。由一元线性回归方程推算出桑葚多糖的质量。桑葚多糖的提取率即为样品中桑葚多糖的质量与样品干燥粉末质量的百分比。

2.3 标准曲线的绘制

精密称取干燥(105℃)至恒重的葡萄糖2.5 mg，加蒸馏水定容至50 mL，得标准葡萄糖溶液。取标准葡萄糖溶液 0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，定容至50 mL，得不同浓度的稀释液。分别精密吸取上述稀释液1 mL按“2.2”中方法显色，测定吸光度值，以吸光度(A)对质量浓度C(mg/mL)进行回归，得回归方程。由标准曲线数据计算出一元线性回归方程为:Y=0.1069X－0.0057(其中Y指的是葡萄糖的含量，X表示吸光度)，r=0.9998，表明对照品葡萄糖含量在0.010～0.050 mg/mL范围内与对应吸光度值有良好线性关系。

2.4 单因素实验设计

由于酶解温度、酶用量、酶解时间和pH对纤维素酶酶解影响较大，所以对纤维素酶提取桑葚多糖这4个因素进行研究，根据单因素试验的结果和对简化提取工艺的考虑，确定pH值为蒸馏水的自然值。最终筛选对桑葚多糖提取率影响最大的三个因素进行L9(34)正交试验，即酶用量(A)，酶解温度(B)和酶解时间(C)。提取液用0.2 mol/mL磷酸氢二钠与0.1 mol/mL柠檬酸缓冲液调节pH，对提取效果的影响以提取液中多糖含量为指标(总多糖的质量百分数表示)。

(1)酶用量的影响。精密称取桑椹粉1.0 g 5份，分别按加酶量1、2、3、4、5 mL 加入纤维素酶悬浮液，在40℃下酶解提取120 min。测定桑椹多糖含量。结果见表1。

表1 加酶量对多糖得率的影响

在1～5 mL范围内，随着加酶量的增加，多糖得率先上升后下降，最大值出现在3 mL处。其后多糖得率呈下降趋势，这可能是桑椹多糖已基本提取完全，其它杂质进入提取液，使提取液粘度升高，扩散速度变慢，导致多糖不易溶出。

(2)酶解温度的影响。精密称取桑椹粉1.0 g 5份，按加酶量3 mL加入纤维素酶悬浮液，分别在温度30、35、40、45、50 ℃下酶解提取提取120 min。测定桑椹多糖含量。结果见表2。

表2 酶解温度对多糖得率的影响

酶解温度的影响可能包括两个方面，一是温度的增高可以加大多糖在提取液里的溶解度，二是酶解温度会显著影响纤维素酶的活性，表2表明，在30℃～55℃随着温度的升高，多糖得率总体呈先上升后下降趋势，在40℃达最大值，这时的酶解温度最适纤维素酶活性的发挥，随着温度的升高虽然增大了多糖在提取液中的溶解度，但纤维素酶活性的降低，可能导致多糖得率下降。

(3)酶解时间的影响。精密称取桑椹粉1.0 g 5份，按加酶量3 mL加入纤维素酶悬浮液，在40℃下，分别酶解提取 90、120、150、180、210 min。测定桑椹多糖含量。结果见表3。

表3 酶解时间对多糖得率的影响

从表3可知，随着酶解时间的延长，多糖得率呈上升趋势，在150 min时，多糖得率达到最大，之后多糖得率趋于平缓下降，这可能是因为随着时间的延长，加大了酶在多糖提取中的反应时间，使反应充分进行，直至多糖提取完全。但同时也加大了杂质在提取液中的溶解量，故时间过长多糖得率会有所降低。

2.5 正交实验设计

根据单因素试验的结果，以酶用量(A)，酶解温度(B)和酶解时间(C)为因素进行正交试验，每个因素选取三个不同的水平。因素水平见表4，正交试验结果见表5，方差分析见表6。

表4 正交试验因素与水平

表5 纤维素酶辅助提取桑葚多糖条件的L9(34)正交试验结果

表6 方差分析表

正交试验极差分析结果(表3、表4)显示，各因素对酶法提取桑葚多糖的影响大小顺序为B＞C＞A，即酶解温度的影响最大，酶用量的影响最小，从省时的角度考虑，确定桑葚多糖酶辅助提取的最优条件为A3B3C2。即加酶量4.0 mL，反应温度45℃，酶解时间150 min。

2.6 验证试验

取桑椹3份，每份1.0 g，按优选出的工艺进行提取，即按4.0 mL加酶量，在45℃下进行酶解提取150 min。验证试验结果见表7。

表7 验证试验结果

从上表中可知此提取工艺稳定可行。

3 讨论

大多数中药材的细胞壁是由纤维素构成，植物的有效成分往往包裹在细胞壁内;而纤维素是由β－D－葡萄糖以1，4－β－葡萄糖苷键连接，纤维素酶酶解可以促进β－D－葡萄糖苷键的裂解，使植物细胞壁被破坏，有利于植物有效成分的浸出，还能促进残留半乳甘露聚糖主链(1，4－β－葡萄糖苷键连接)的降解，降低提取液的粘度，而提高桑葚多糖的提取率。

桑葚多糖多种多样的生物活性以及在功能食品和临床上的广泛使用，使多糖生物资源成为天然药物、生物化学及生命科学的研究热点［4］。本实验旨在优化桑葚多糖的酶解提取工艺，用蒸馏水为提取剂，以桑葚多糖得率为考察指标，采用正交设计法，得出最佳酶解提取工艺为:加酶量4.0 mL，反应温度45℃，酶解时间150 min。在此条件下，桑葚多糖的最佳提取率为14.77%。高于浸提法的提取率，并缩短了提取时间，降低了提取温度。

本实验采用以蒸馏水为提取剂进行提取，提取效率高，极大地缩短了提取周期，优于文献报道的方法，起到简化工艺流程，节省成本，减少杂质的作用，具有合理、经济、可行的优点，为多糖的提取方法及其工业化生产提供了新手段。

［1］国家药典委员会.中国药典(一部)［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:281.

［2］李 颖，李庆典.桑葚多糖抗氧化作用的研究［J］.中国酿造，2010(4):59－61.

［3］廖森泰，邹宇晓，郑祥明，等.桑宁茶多糖对糖尿病小鼠的降血糖作用研究［J］.蚕业科学，2004(3):327－329.

［4］惠贤民.大孔吸附树脂纯化桑葚多糖的工艺研究［J］.安徽农业科学，2009(6):2572－2573.

［5］傅国强，谢明勇，周 鹏，等.纤维素酶法提取茶多糖［J］.无锡轻工大学学报，2002，21(4):362—366.

［6］邢秀芳，马桔云，于宏芬，等.纤维素酶在葛根总黄酮提取中的应用［J］.中草药，2001，32(1):37—38.

［7］邱丹萍，邹永芳，黄锁义，等.白茅根多糖提取方法的比较研究［J］.中国酿造，2010(1):108－110.