狂犬病病毒减毒株的研究及应用进展

邹 剑，俞永新

狂犬病是由狂犬病病毒引起的中枢神经系统感染的人兽共患病，全世界每年造成的死亡人数估计为55 000（90%CI：24 500－90 800），主要集中在亚洲和非洲的发展中国家，其中约56%发生在亚洲，44%发生在非洲［1］。目前印度是全世界狂犬病最流行的国家，每年约有20 000人死于狂犬病，大约96%的人狂犬病病例都是由犬咬伤所致，这其中由宠物犬咬伤所占的比例为11%，其余大多是流浪犬所致［2］。我国也是狂犬病严重流行的国家之一，发病人数仅次于印度居世界第2位。2007年全国报告死亡病例数高达3 300人，2008和2009年狂犬病死亡人数都超过2 400人，一直位列我国各类传染病报告死亡数的前3位［3］。上世纪80、90年代开始欧美多个国家使用减毒活疫苗或重组活疫苗用于狂犬病毒宿主的免疫计划，使得野生动物狂犬病的数量大大降低，间接地降低了由野生动物传染至家养动物及人的可能性，产生了良好的社会经济效应。我国大部分城市地区都有针对宠物犬、猫的注射免疫接种计划，但农村地区散养的犬、猫数量大、分布广，注射灭活疫苗受到操作难度大、接种次数多、效期短、需要组织大量人力，还有咬伤工作人员的危险等因素的限制。而由狂犬病病毒减毒株制备的口服活疫苗不仅能够诱导更强的固有及适应性免疫反应，减少接种次数和剂量，而且具有疫苗成本低，操作方便，利于推广的很多优点。因此WHO推荐使用减毒活疫苗用于野生动物及流浪犬只狂犬病的防治。鉴于我国狂犬病防治的严峻形势（犬群数量大，约7 500万只，农村地区犬只免疫率仅为10%～20%，猫则几乎没有免疫，野生动物狂犬病的防治还存在空白等［3］），有必要研制狂犬病毒口服活疫苗。

1 现有狂犬病病毒减毒株的筛选和应用

1．1 现有狂犬病病毒减毒株的筛选 国外最早于上世纪60年代开始研制狂犬病毒减毒口服活疫苗，主要用于野生动物狂犬病的防治，陆续筛选出了SAD，ERA，SAD－Bern，SAD VA1，SAD B19，SAD P5／88，Vnukovo－32，SAG1，SAG2 减 毒 株。所有这些减毒株都来源于1935年从美国亚拉巴马州一只死亡的犬脑内分离的毒种［4］，经鼠脑、地鼠肾细胞、鸡胚等传代减毒后成为固定毒，命名为SAD。SAD再经Evelyn，Rokitniki，Abelseth 3位科学家在多种细胞系传代适应减毒，为纪念3位科学家将该毒株命名为ERA株［5］。70年代初瑞士科学家从美国疾病控制中心获得该毒株，经BHK－21细胞进一步适应后得到SAD－Bern减毒株。在欧洲，SADBern减毒株是第一个SAD毒种来源的成功应用于狐狸狂犬病防治田间试验的毒种［6］。在SAD－Bern减毒株的基础上，德国科学家将SAD－Bern毒种继续在BHK－21细胞上克隆筛选获得了对温度敏感且对啮齿动物低毒力的SAD B19株，以及其它突变株SAD P5／88株；另外将SAD－Bern株在BSR细胞上突变获得SAD VA1株［7］；前苏联也用SAD来源的毒种获得了对温度敏感的Vnukovo－32减毒株，以上几种与SAD有关的减毒株对成年小白鼠（脑内、肌肉、口服）和其它啮齿动物都有一定致病性，但对大型肉食动物口服后的安全性较好。1989年Tuffereau等发现糖蛋白第333位精氨酸是CVS和ERA株毒力的关键位点［8］。鉴于以上发现，法国科学家用狂犬病病毒G蛋白单克隆抗体对SAD－Bern株加压筛选得到SAG1株。SAG1株编码G蛋白第333位氨基酸的密码子发生AGA到AGC的突变，相应氨基酸由精氨酸变为丝氨酸（Arg333→Ser333）；同理在SAD－Bern株的基础上经过G蛋白单克隆抗体的两步加压筛选，第1次筛选得到SK株，G蛋白第333位氨基酸密码子由AGA突变为AAA，编码的氨基酸由精氨酸变为赖氨酸（Arg333→Lysr333），再对SK株按同法筛选得到SAG2株，其G蛋白第333位氨基酸密码子由AAA突变为GAA，编码的氨基酸由赖氨酸变为谷氨酸（Arg333→Glu333），因此SAG2不仅突变了原代SAD－Bern株G蛋白第333位精氨酸的关键毒力位点，而且密码子发生了两个位点的突变（AGA→GAA），相比于SAG1的单位点突变（AGA→AGC），进一步降低了回复突变为精氨酸发生毒力回复的可能性［9－10］（图1）。

图1 现在狂犬病毒减毒株的筛选历史SAD：Street Alabama Dufferin；ERA：Evelyn Rokitniki Abelseth；AGA：SAD－Bern G蛋白第333位精氨酸密码子；AAA：SAG1G蛋白第333位丝氨酸密码子；GAA·SAG·G蛋白第33码位谷氨酸密码子

我国也于上世纪70、80年代引进国外LEPFlury株和ERA株生产弱毒兽用疫苗，用于牛、马、家犬等牲畜的注射免疫。另外原中国药品生物制品检定所（现中国食品药品检定研究院）将我国人用狂犬病疫苗生产用毒种CTN－1株以及CTN－M株口服拌喂家犬，在对上万只家犬进行的田间试验表明弱毒活疫苗对犬安全并且能有效降低家犬狂犬病的发生［11－12］。军事医学科学院侯世宽等人还以SAD B19株为亲本株通过噬斑挑选出中等大小的克隆株SRV9株，经初步动物实验表明具有良好的免疫原性和安全性［13］。

1．2 现有狂犬病病毒减毒株的安全性评价 考虑到减毒株的残余毒力，以及毒力回复突变的可能性，WHO专家咨询会对口服减毒株的安全性评价及监测做出了详细规定，并制定了《狂犬病口服疫苗研制及田间试验指导原则》，主要包括疫苗对靶动物和非靶动物的致病力以及动物摄食后病毒在动物体内的分布及唾液的排毒情况等。要求对候选疫苗株在实验室条件下以10倍于田间试验的剂量通过口服或肌肉注射的方式，对10周龄以下的幼犬应不致病。另外应在靶动物口服疫苗后的第1d开始收集唾液标本，至少连续7d，以验证唾液是否排毒［14］。以SAD B19减毒株为例，Neubert等用SAD B19减毒株经不同途径接种包括狗、猫、水貂、雪貂、狒狒、鸡等在内的多种靶动物和非靶动物后都未发现SAD B19引起的狂犬病，少数啮齿类动物出现致病性（大鼠致病率5．8%，小鼠致病率2%）［15］。Vos等使用商业化的SAD B19减毒活疫苗诱饵（每个诱饵含1×107．9TCID50／mL）口服免疫臭鼬后未发现病毒诱发的狂犬病，1d后收集唾液和鼻腔分泌物未发现残余病毒［16］。从实际应用的监测结果来看，德国、奥地利在投放上千万例的SAD B19减毒活疫苗诱饵后只确证7例由该减毒株引起的野生动物狂犬病例（德国6例，奥地利1例）［17］。

由于减毒株存在回复突变的风险，因此验证减毒株的遗传稳定性也是安全性评价的重要方面，Beckert等将SAD B19毒株在狐狸和小鼠脑内分别连续传4代和10代，在狐狸传代过程中第9240位核苷酸（L基因上）发生A到G的突变，编码的氨基酸由Gln变为 Arg，但未发现毒株毒力的改变［18］。最近Austin等人运用分子进化遗传学的方法对SAD B19与狂犬病病毒街毒株的种系发生分析显示，街毒株在编码区及非编码区都存在大量的非同义替换，净化选择（负向选择）远大于SAD B19毒株。该研究从进化的分子机制上解释了SAD B19减毒株的遗传稳定性［19］。除SAD B19减毒株外，SAG1、SAG2减毒株由于其第333位精氨酸毒力的关键位点发生了改变，显示了更低的残余毒力，对成年小鼠和其他野生啮齿动物经口服、肌肉、脑内途径接种均不致病，多项研究表明对多种哺乳类动物，包括大多数狂犬病毒的存储宿主没有致病性［20］。特别是SAG2的遗传稳定性更高，在乳鼠脑内传代后未发现毒力的回复突变，已被WHO推荐作为野生动物和犬的口服减毒活疫苗生产用毒种［1］。

1．3 现有减毒口服活疫苗的应用效果 在欧洲由SAD B19、SAD P5／88、SAG1、SAG2减毒株制成的口服兽用活疫苗被广泛的应用于野生动物狂犬病的防治中［21］。从1983起，德国和奥地利共投放了超过9 700万例的SAD B19、SAD P5／88减毒活疫苗诱饵。在1982－1992间，法国也投放了超过60万例的SAD B19活疫苗诱饵［22］。德国和奥地利分别于1950年和1966年出现首例狂犬病例，1983年和1990年到达顶峰，分别达到了10 484例和2 514例，大面积使用减毒活疫苗诱饵后德国和奥地利的狂犬病例大幅下降（2003年德国发现23例，奥地利仅1例）［17］。SAG1，SAG2减毒活疫苗诱饵主要在法国、瑞士、比利时、卢森堡、爱沙尼亚等国家和地区使用。从法国、爱沙尼亚的使用情况来看，法国最早从1990开始使用SAG1，SAG2减毒活疫苗诱饵，使用面积覆盖了主要发生狂犬病的区域（约140 000 km2），免疫之后，法国动物狂犬病例大幅下降，到1998年只监测到2例狐狸和猫的狂犬病［22］。爱沙尼亚从2004年开始采用SAG2减毒活疫苗诱饵用于野生动物狂犬病的防治计划，最初使用范围局限在零星的岛屿和北部野生动物狂犬病高发区，后推广到全境，通过口服免疫计划，爱沙尼亚的野生动物狂犬病例数也由2003年最高峰时的841例下降到2006年的114例［23］。目前，通过口服减毒活疫苗的免疫计划，比利时、卢森堡、法国、意大利、瑞士、芬兰、荷兰已基本消灭陆生动物狂犬病。

2 新型狂犬病毒减毒株

早在1994年，Schnell等就已成功拯救出了狂犬病病毒［24］，近年来随着该技术的日益成熟，基于反向遗传学的基因操作被广泛的应用于狂犬病毒的分子生物学研究当中，其中包括毒力的研究以及新型减毒活疫苗、嵌合病毒、病毒载体的研究。新型减毒活疫苗的研究一般以现有的减毒株为基础，例如以SAD B19的cDNA克隆拯救得到的SPBN系列基因工程株，从RC－HL拯救得到的R（NPMGGL）株和以 HEP－Flury株为基础构建 的 def－P HEP－Flury株，通常采取以下构建策略：①在分子水平上定向改造已知的毒力位点以进一步降低原代减毒株的残余毒力；②在G－L基因之间含423个碱基的伪基因 Ψ区插入外源基因，增强免疫原性，降低毒力；③直接构建缺陷株，以获得更安全的减毒株。具体可分为以下四类。

2．1 突变毒力相关位点 SPBN株由SAD B19拯救得到，SAD B19对小鼠脑内注射有部分残余毒力，已知G蛋白333位精氨酸是该毒株毒力的关键位点［8］。2002年，Faber等将SPBN 株 G蛋白第333位精氨酸定点突变为谷氨酸（Arg333→Glu333），得到SPBNGA株（突变后的G蛋白记做GA），该株对成年小鼠脑内注射不致病［25］。但2005年Faber等发现SPBNGA株在新生乳鼠脑内传5代后发生毒力回复，对成年小鼠脑内注射致病，与原代毒株比较后未发现G蛋白第333位氨基酸未发生回复突变，但G基因第637位至639位密码子由ATT突变为AAG或AAA，导致G蛋白第194位氨基酸由天门冬氨酸突变为赖氨酸（Asn194→Lys194），该突变株命名为SPBNGA－K株。Faber等将SPBNGA－K株G蛋白第194位氨基酸定点突变为丝氨酸（Lys194→Ser194）后重新得到对小鼠脑内注射无致病力的SPBNGAS株（突变后的GA蛋白记做GAS），且毒力更稳定，经乳鼠脑内传5代后未出现毒力回复［26］。

2．2 双联或三联突变G基因的减毒株 大量的研究表明G蛋白是诱导产生狂犬病毒中和抗体最重要的保护性抗原［27－28］，2002年，Faber等在 SPBNGA株基础上额外插入GA基因得到SPBNGA－GA株，SPBNGA－GA株同SPBNGA株在BSR细胞的增殖滴度相近，但SPBNGA－GA G蛋白的表达量约为SPBNGA的1．6倍。通过比较神经细胞线粒体的呼吸强度和Caspase 3凋亡途径的活性，表明SPBNGA－GA比SPBNGA更能诱导神经细胞的凋亡，免疫小鼠后，用快速荧光灶抑制试验测得在低剂量条件下（103FFU和102FFU）SPBNGA－GA产生的中和抗体效价更高，两周后用100LD50的CVS攻击，小鼠保护率同产生的抗体效价成正比，SPBNGA－GA组更有效地抵抗病毒的攻击［25］。2009年Faber等在SPBNGAS株基础上［23］，同时将2个到3个突变的G蛋白基因插入到SPBNGAS中分别得到 SPBAANGAS－GAS 和 SPBAANGAS－GASGAS株，另外插入两个起始密码子被打乱的GAS基因 到 SPBNGAS中 得 到 SPBAANGAS－GAS（－）－GAS（－）株作为对照。在细胞内培养2d后SPBAANGAS－GAS－GAS株可以达到107FFU／mL的感染滴度，对乳鼠脑内注射（103TCIU）后发现，只有SPBAANGAS－GAS－GAS对5日龄和10日龄乳鼠完全无致病力。将SPBAANGAS－GAS－GAS株（107FFU）和高致病力 DOG4RV 株（100IC－LD50）混合注射到小鼠脑内，小鼠100%存活。经检测发现SPBAANGAS－GAS－GAS株诱导小鼠血脑屏障通透性增强，能募集更多的淋巴细胞进入到小脑和大脑皮层。预先用106FFU高致病力的DOG4毒株肌内感染，再用107FFU 的SPBAANGAS－GASGAS减毒株在感染48，72，96，120h后脑内注射，对小鼠都有100%的保护力；改用108FFU的SPBAANGAS－GAS－GAS减毒株在感染 DOG4毒株16，24，48，72h后肌内注射，对小鼠的保护力分别能达到 90%，55%，40%，30%。SPBAANGASGAS－GAS株对乳鼠的不致病性和良好的免疫原性甚至对暴露后免疫的部分疗效使得该减毒株有望用于人的暴露前和暴露后治疗［29］。

同理，2006年Hosokawa等利用RC－HL株的反向遗传学系统在RC－HL株的基础上构建成功了含两个G蛋白的R（NPMGGL）株，随后的一系列研究显示R（NPMGGL）株同RC－HL株在细胞内的增殖情况相似，但G蛋白的表达量是RC－HL株的1．5倍，电镜下R（NPMGGL）的病毒颗粒也比RC－HL的颗粒大，灭活免疫小鼠后产生的抗体滴度也更高［30］。

2．3 插入增强免疫反应的外源基因 由于凋亡细胞能促进树突状细胞的成熟和抗原的呈递并能释放细胞因子诱导限制性T细胞的活性，刺激产生更强的免疫反应，2001年，Pulmanausahakul等将促进细胞凋亡的细胞色素c（Cyto c）基因插入SPBN株G和L基因的非编码序列之间，构建了［SPBN－Cyto c（＋）］株，该株在体外能大量表达细胞色素c，免疫小鼠后发现无论是诱导产生的的中和抗体滴度还是对病毒攻击的保护力［SPBN－Cyto c（＋）］株都优于［SPBN－Cyto c（－）］株，有效保护剂量比后者低20倍［31］。已知TNF－α在抗细菌和抗病毒感染中发挥重要作用［32］，2005年，Faber等还构建了能表达可溶性 TNF－α 的 ［SPBN－TNF－（＋ ）］株 和 膜 结 合TNF－α的SPBN－TNF－（MEM）株以及不表达 TNF－α的［SPBN－TNF－（－）］株，三株在神经细胞的增殖能力相近，最终都能达到107FFU／ml，以106FFU的感染剂量鼻腔内免疫TNF－α基因缺陷型小鼠，发现只有［SPBN－TNF－（＋）］对小鼠完全不致病，组织切片染色后发现［SPBN－TNF－（＋）］株多集中在海马回，［SPBN－TNF－（－）］主要分布在大脑皮层，SPBNTNF－（MEM）在海马回和大脑皮层平均分布，［SPBN－TNF－（＋）］感染的小鼠柔脑膜和大脑实质的血管周围能明显的检测到以白细胞浸润和T细胞募集为特征的炎症反应，这些发现都提示TNF－α的表达可能直接抑制病毒在神经细胞的复制和传播，并且增强了血脑屏障的通透性，有助于淋巴细胞进入中枢神经系统清除狂犬病毒的感染［33］。趋化因子是一类诱导炎症反应的重要细胞因子，2010年Ling Zhao等构建了表达趋化因子 MIP－1α（CCL3）的重组病毒rHEP－MIP1α株，通过比较其它重组病毒株 （rHEP－MIP1α（－），rHEP，rHEP－IP10）发 现MIP－1α的表达有助于在免疫部位更有效的募集树突状细胞，增强对抗原的呈递作用，刺激B淋巴细胞产生更高滴度的狂犬病毒中和抗体［34］。

2．4 基因缺陷型减毒株的构建 基因缺陷型病毒不能单独完成自身复制，因此有更好的安全性。构建基因缺陷型病毒也成为研制新型狂犬病毒减毒活疫苗的重要策略之一。2004年Youko Shoji等以HEP－Flury弱毒株为基础构建了缺失整个P基因的def－P HEP－Flury缺陷株，通过 NIH 法以10×106FFU的剂量免疫小鼠，能100%抵抗CVS毒株的攻击［35］。2005年，Ito N 等利用RC－HL株的反向遗传学系统构建成功缺失M基因的缺陷株RCHLΔM株，肌内免疫和鼻腔免疫都能有效的诱导中和抗体，但增殖效率较低，最多只能达到6．1×105FFU／ml［36］。同理，2008年Jonathan等也构建了缺失狂犬病毒P基因的缺陷株SPBN－ΔP株，另外还在SPBN－ΔP株的基础上额外插入1个G蛋白基因得到SPBN－ΔP－RVG株，小鼠肌内注射三个剂量（105FFU，104FFU，103FFU）的活疫苗，SPBN－ΔP株诱导的抗体中IgG1a和IgG2a两个亚型的量相当，SPBN－ΔP－RVG诱导产生IgG2a亚型为主的抗体，而IgG2a被认为能够提供更好的保护力。用缺陷型病毒对免疫缺陷小鼠腓肠肌注射后小鼠不致病，在脊髓和大脑也检查不到缺陷株的 RNA［37－38］。这些缺陷株的共同特点是病毒只在表达外源P蛋白或M蛋白的细胞系中才能增殖，对乳鼠、免疫缺陷鼠不致病，但往往增殖滴度较低，由于缺乏自我复制的能力以及缺失部分结构蛋白，免疫原性不如完整病毒。

3 结 语

目前WHO推荐使用残余毒力低的SAG2减毒活疫苗和重组痘病毒载体活疫苗（VRG）用于狂犬病的口服免疫计划，从欧美等多个国家的使用情况来看，减毒或重组狂犬病毒口服活疫苗在控制和消灭陆生动物狂犬病方面取得了巨大成功［39－40］，并大大节约了狂犬病防治成本，Shwiff等对德克萨斯州1995年至2006年家养犬和郊狼的口服狂犬病活疫苗免疫计划支出和收益研究显示，按不同的暴露后治疗的比例来计算，口服狂犬病活疫苗免疫计划的收益大约为成本支出的3至13倍（支出26 358 221美元，收益89 000 000美元至346 000 000美元，相当于口服免疫计划每花费1美元可节约3．38美元至13．12美元）。减少的支出主要来自于减少的暴露后治疗和对动物狂犬病的检测费用上［41］。按我国现有人口规模和人口比例估算，所有的狂犬病暴露后预防均得到处理，每年约需245亿元（农村地区约170亿元、城市地区约75亿元）［3］。狂犬病已成为我国公共卫生安全防控的巨大负担。

近年来新型减毒株的设计为我们开发更高效、安全的口服活疫苗提供了新的思路，并显示出一定程度的实际应用的前景，例如，2004年Dietzschold等证明了SPBNGA和SPBNGA－GA株具有良好的热稳定性和在生物反应器中培养的高增殖滴度［42］。2005年Amy等将已构建的新型狂犬病毒SPBNCyto c株，SPBNGA株，SPBNGAGA株和SN10－333株（从SAD B19株通过定点突变第333位精氨酸突变为谷氨酸得到），同已经商业化应用的VRG（重组痘病毒载体活疫苗）比较，在相同的病毒滴度下（108TCID50／mL）通过口服免疫的方式测定这几种疫苗对犬的保护力，免疫保护力相当，能100%的保护街毒株的攻击，且没有活疫苗诱发的狂犬病［43］。特别是新的 SPBAANGAS－GAS－GAS减毒株具有毒力高度减弱（对乳鼠脑内接种不致病），免疫保护力良好（暴露后接种1针即可达到有效保护）的特性，因此具备研制成一种可用于人类狂犬病暴露后治疗的减毒活疫苗的前景。总得来说，针对我国目前狂犬病防控的严峻形势，研制高效、安全适合应用于流浪犬和野生动物的口服减毒活疫苗具有重大现实意义［44］，争取在2020年之前实现 WHO计划的基本控制狂犬病的目标。

［1］WHO expert consultation on rabies，1st report．Technical report series no．931［R］．Geneva：World Health Organization．2005．

［2］Association for the Prevention and Control of Rabies in India．Assessing the burden of rabies in India：a national multicentric survey．［R］．Bhubaneswar，India：Association for the Prevention and Control of Rabies．2003．

［3］卫生部．中国狂犬病防治现状［R］．2009．

［4］Fenje P．Propagation of rabies virus in cultures of hamster cells［J］．Can JMicrobiol，1960，6：479－84．

［5］Abelseth MK．An attenuated rabies vaccine for domestic animals produced in tissue culture［J］．Can Vet J，1964，5：279－86．

［6］Steck F，Haeflinger U，Stocker C．Oral immunization of foxes against rabies［J］．Experientia，1978，34：1662．

［7］Schneider LG．Tollwut－Lebendimpfstoff （sicher in Englisch）［R］．European Patent Office，1993．

［8］Tuffereau C．Arginine or lysine in position 333of ERA and CVS glycoprotein is necessary for rabies virulence in adult mice［J］．Virology，1989Sep，172（1）：206－12．

［9］Artois M，Cliquet F，Barrat J．Effectiveness of SAG1oral vaccine for the long－term protection of red foxes（Vulpes vulpes）against rabies［J］．Vet Rec 1997，140：57－9．

［10］Lafay F，Benejean J，Tuffereau C．Vaccination against rabies：construction and characterization of SAG2，a double avirulent derivative of SAD Bern［J］．Vaccine，1994，12：317－20．

［11］郑海发，刘景华，严子林，等．Vero细胞口服狂犬病疫苗的研究［J］．中国人兽共患病杂志，1996，12（1）：27－30．

［12］褚菊仁，严子林，欣悦翔，等．犬用口服狂犬病疫苗的研究［J］．生物制品学杂志，1989，2（2）：26．

［13］侯世宽，岳军明．狂犬病口服疫苗株的筛选、鉴定和实验免疫研究［J］．中国人兽共患病杂志，1995，11（6）：145－148．

［14］WHO．Guidance for research on oral rabies vaccines and field application of oral vaccination of dogs against rabies［R］．Geneva，Switzerland，2007．

［15］Neubert L，Vos A，Pommerening E．Safety studies of the oral rabies vaccine SAD B19in Striped Skunk（Mephitis mephitis）［J］．Journal of Wildlife Diseases，2002，38（2）：428－431．

［16］VOS A，NEUBERT A，AYLAN O．An update on safety studies of SAD B19rabies virus vaccine in target and non－target spe－ciesJ ．Epidemiol Infect1999123165－175．

［17］Thomas Muller，H．J．Analysis of vaccine－virus－associated rabies cases in red foxes（Vulpes vulpes）after oral rabies vaccination campaigns in Germany and Austria［J］．Arch Virol，2009，154（7）：1081－91．

［18］Beckert A，Geue L，Vos A．Genetic stability（in vivo）of the attenuated oral rabies virus vaccine SAD B19［J］．Microbiol Immunol，2009，53：16－21．

［19］Austin L．Hughes．Relaxation of purifying aelection on the SAD lineage of live attenuated oral vaccines for rabies virus［J］．Infect Genet Evol，2009September，9（5）：827－831．

［20］Cathleen A，Hanlon，Michael Niezgoda．Oral efficacy of an attenuated rabies virus vaccine in Skunks and Raccoons［J］．Journal of Wildlife Diseases，38（2），2002：420－427．

［21］俞永新．人和动物狂犬病防制研究进展［J］．中国人兽共患病杂志，1998，14（4）：56－60．

［22］Cliquet F，Combes B，Barrat J．Means used for terrestrial rabies elimination in France and policy for rabies surveillance in case of re－emergence［J］．Dev Biol（Basel），2006，125：119－26．

［23］Enel Niina，Lainea M，Guiot AL．Rabies in Estonia：Situation before and after the first campaigns of oral vaccination of wildlife with SAG2vaccine bait［J］．Vaccine，2008（26）：3556－3565．

［24］Schnell MJ，Mebatsion T，Conzelman K．Infectious rabies virus from cloned cDNA［J］．EMBO J，1994，13：4195－4203．

［25］Milosz Faber，Rojjanaporn Pulmanausahakul，Suchita S．Overexpression of the rabies virus glycoprotein results in enhancement of apoptosis and antiviral immune response［J］．Journal of virology，Apr，2002：3374－3381．

［26］Milosz Faber，Marie－Luise Faber．A single amino acid change in rabies virus glycoprotein increases virus spread and enhances virus pathogenicity［J］．J Virol，2005（12）：14141－14148．

［27］Cox J，Dietzschold．Rabies virus glycoprotein II．Biological and serological characterization［J］．Infect Immun，1997，16：754－759．

［28］Dietzschold B，Wiktor T J，MacFarlan R．Antigenic structure of rabies virus glycoprotein：ordering and immunological characterization of the large CNBr cleavage fragments［J］．J．Virol，1982，44：595－602．

［29］Milosz Faber，Rhonda B．Effective preexposure and postexposure prophylaxis of rabies with a highly attenuated recombinant rabies virus［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（27）：11300－5．

［30］Hosokawa－Muto J，Ito N，Yamada K．Characterization of recombinant rabies virus carrying double glycoprotein genes［J］．Microbiol Immunol，2006，50（3）：187－96．

［31］Pulmanausahakul R，Faber M，Morimoto K．Overexpression of cytochrome C by a recombinant rabies virus attenuates pathogenicity and enhances antiviral immunity［J］．J Virol，2001November，75（22）：10800－10807．

［32］Blum A，Miller H．The major histocompatibility complex and inflammation［J］．South Med J，2000，93：169－172．

［33］Milosz Faber，Michael Bette．Overexpression of tumor necrosis factor alpha by a recombinant rabies virus attenuates replication in neurons and prevents lethal infection in mice［J］．J Virol，Dec，2005：15405－15416．

［34］Ling Zhao，Harufusa Toriumi，Hualei Wang．Expression of MIP－1α（CCL3）by a recombinant rabies virus enhances its immunogenicity by inducing innate immunity and recruiting dendritic cells and B cells［J］．Journal of virology，2010：9642－9648．

［35］Youko Shoji，Satoshi Inoue，Kazuo Nakamichi．Generation and characterization of P gene－deficient rabies virus［J］．Virology，2004（318）：295－305．

［36］Naoto Ito．Characterization of M gene－deficient rabies virus with advantages of effective immunization and safety as a vaccine strain［J］．Microbiol Immunol，2005，49（11）：971－979．

［37］Jonathan Cennaa，Papaneri．Immune modulating effect by a phosphoprotein－deleted rabies virus vaccine vector expressing two copies of the rabies virus glycoprotein gene［J］．Vaccine，2008（26）：6405－6414．

［38］Roy A，Hooper DC．Immune evasion by rabies viruses through the maintenance of blood－brain barrier integrity［J］．J Neurovir－ol，2008，14：401－411．

［39］Slate D，Algeo TP，Nelson KM．Oral rabies vaccination in north America：opportunities，complexities，and challenges［J］．PLoS Negl Trop Dis，2009，3（12）：549．

［40］Cliquet F，Aubert M．Elimination of terrestrial rabies in Western European countries［J］．Dev Biol（Basel），2004；119：185－204．

［41］Shwiff SA，Kirkpatrick KN，Sterner RT．Economic evaluation of an oral rabies vaccination program for control of a domestic dog and coyote rabies epizootic：1995－2006［J］．J Am Vet Med Assoc，2008，233（11）：1736－41．

［42］Marie Luise Dietzschold．In vitro growth and stability of recombinant rabies viruses designed for vaccination of wildlife［J］．Vaccine，2004（23）：518－524．

［43］Charles ER，Cathleen AH，Jesse B．Oral vaccination of dogs with recombinant rabies virus vaccines［J］．Virus Research，2005，（111）：101－105．

［44］俞永新．中国预防控制狂犬病降低发病率的思考［J］．中国计划免疫，2007，13（4）：391－398．