水貂粪便乳酸杆菌的分离与鉴定

刘国庆，赵鹏伟，温建新，刘 坤

（1.胶南市动物疾病控制中心，山东青岛 266400；2.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109；3.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

近年来，水貂等小型毛皮动物消化道菌群的研究已成为一个重要的新课题，但是，目前国内对水貂肠道菌群的研究未见报道。为了进一步研究肠道有益菌对动物机体的影响。其中，乳酸菌作为动物肠道中的优势菌群之一，其对动物的有益作用已被许多研究结果所证实[1]。因此，我们采用水貂粪便，分离纯化乳酸杆菌，利用生化试验进行鉴定，从而确定水貂消化道中的优势乳酸杆菌的种属及数量、耐酸试验、药敏试验等，为水貂饲料的乳酸杆菌添加剂的开发，提高水貂的健康水平和经济效益都有极其重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 粪便来自成年丹麦红眼母貂，并分别标记为1号、2号、3号，放入灭菌的平板密封置4℃备用。

1.1.2 主要试剂 营养琼脂培养基（国药集团化学试剂有限公司）、莫匹罗星锂盐改良MRS培养基（青岛高科园海博生物技术有限公司）、营养肉汤培养基、五糖发酵管（葡、麦、蔗、乳、甘）、H2S、靛基质、MR试剂、VP试剂、吲哚试剂、葡萄糖蛋白胨水、三糖铁培养基、药敏纸片（购自杭州天和微生物试剂有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 样品的采集与处理 取粪便样品1号、2号、3号各2 g，分别置于含生理盐水198 mL锥形瓶，制成10-2梯度稀释液。振荡混匀30 min，制成匀浆后，静置15 min。依次制成梯度为10-2，10-3，10-4，10-5四个梯度的样品稀释液。

1.2.2 分离纯化 取样品的稀释液100 μL于MRS培养基上，厌氧37 ℃培养2~3天。挑取典型菌落，进行革兰氏染色镜检。疑似阳性的菌落接种到莫匹罗星锂盐改良MRS培养基中纯化培养。

1.2.3 生化试验鉴定 挑取染色为阳性的无分叉菌落，按照常规的方法进行过氧化氢酶试验，KOH试验，吲哚试验、硫化氢试验、三糖铁穿刺试验；糖发酵试验[2]、MR试验、VP试验。

1.2.4 耐酸试验 用营养肉汤将乳酸杆菌制成菌悬液。然后调节营养肉汤pH值为5.0、4.0、3.0、2.0，分别装入试管中，每管装4 mL。将菌株液体培养物10 μL接入到不同pH值的营养肉汤中，37 ℃厌氧培养18h，判定菌株生长情况。

1.2.5 药敏试验 将乳酸菌悬液取100 ul涂布于MRS培养基上，用灭菌的镊子将药敏片贴到培养基表面，轻轻压实。将培养基置于37 ℃培养24 h，测定药敏圈直径。

2 结果与分析

2.1 菌落形态及镜检结果 分离出4株镜检为革兰氏阳性的杆菌，分别命名为A1，A2，A3，A4。菌落形态多为中央凸起、边缘整齐、黄色或白色半透明状菌落约0.5~3 mm之间。分离株乳酸菌细胞形态有长杆、短杆，多数呈链条状排列。

2.2 生化试验鉴定结果

试验分离到的4株革兰氏阳性杆菌能够在pH4.5的营养肉汤中生长。其次过氧化氢酶试验，KOH试验、吲哚试验、硫化氢试验、三糖铁穿刺试验，皆为阴性，初步鉴定为乳酸杆菌属（L.actobacillus）。

4株菌株的MR试验均为阴性，VP试验均为阳性。A1，A2，A3菌株对七叶灵、果糖、乳糖、麦芽糖和蔗糖发酵试验均为阳性，甘露醇和山梨糖发酵试验为阴性，A1和A3菌株对葡萄糖和甘露糖试验结果不明显。A2菌株棉籽糖测定结果不明显。综上，可将A1，A2，A3菌株鉴定为嗜酸性乳酸杆菌（L.acidophilus）。A4株对七叶灵、果糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、山梨糖和蔗糖试验均显阳性，甘露糖和棉籽糖试验显阴性，综上，可将A4菌株基本鉴定为干酪乳酸杆菌（L.casei）。

2.3 耐酸性实验结果

根据生化鉴定结果，选择A1和A4两种菌株进行不同pH值生长情况试验。判定试验结果标准是依据营养琼脂培养液基底部是否有白色沉淀，如果有白色沉淀，摇动呈浑浊状，说明菌株在此培养条件下能够进行繁殖生长。结果表明，pH值在2.0和3.0，培养效果基本相同，在培养液底部的白色沉淀比较少，说明菌株在此pH不能生长。但是当pH值上升到4.0时，两种菌株的培养液底部都有一定程度的白色沉淀，而且A1菌株沉淀最多，说明其在pH为4.0左右时适宜生长。当pH为5.0时，A1，A4菌株的培养液底部也有沉淀。

2.4 药敏试验结果

用标准敏感菌株金黄色葡萄球菌ATCC25923（S.aureus ATCC25923）作为质控菌，试验菌对抗生素的药敏性参照WHO提供的NCCLS的标准进行判断。对A1和A4菌株进行了药敏试验，得到A1和A4菌株对8种抗生素的药敏结果。通过试验结果可以看出，A1菌株对青霉素、庆大霉素、氨苄西林和氯霉素有一定的耐药性，其中对青霉素和氨苄西林的耐药性较强，而对其余的几种抗生素则表现为敏感；A4菌株对青霉素、氨苄西林和环丙沙星表现了耐药性，其中对青霉素和环丙沙星的耐药性较强，对其余的几种抗生素则表现为敏感。

3 讨论

3.1 菌种鉴定方法的讨论

近些年来，随着技术的发展，基因鉴定方法流行起来，基因鉴定主要是通过PCR技术对乳酸杆菌产物的分析检测，以获得基因组DNA在待测区域内的多态性进行鉴别。通过试验我们可以发现，各种乳酸杆菌在表型上十分相似，用传统的生化试验进行分离，的确造成了一定的困难。日本的M.Sami和Y.Tsuchiya等已在PCR法检测乳酸杆菌方面做了一些研究[3-4]，因此期望在此基础上能探索出一种快速、高效、准确的方法来鉴定乳酸杆菌。

3.2 耐酸性试验的讨论

耐酸性试验的目的是研究乳酸杆菌在不同pH值的生长情况。动物胃中的pH值为2.0~6.0，口服是益生菌进入肠道的主要途径，因此，益生菌株必须有良好的耐酸能力，才能通过高酸性的胃环境到达肠道发挥能力。本实验结果表明，乳酸杆菌A1和A4具有比较强的耐酸性，这与李太元等[5]的报道结果相符。因此，A1和A4这2种菌株完全能适应动物胃肠道环境，作为微生态制剂用菌种具有良好的潜力。

3.3 药敏试验讨论

从实验中可以看出，A1菌株嗜酸性乳酸杆菌对于先锋V、克林霉素、红霉素、阿米卡星比较敏感，对于青霉素、庆大霉素、氨苄西林以及氯霉素表现出了不同程度的耐药性。而A4菌株干酪乳酸杆菌对于庆大霉素、先锋V、红霉素、阿米卡星以及克林霉素比较敏感，对于青霉素、氨苄西林以及环丙沙星有一定的耐药性。李平兰[6]研究了微生态制剂生产中常见的几种乳酸菌对8大类30种常用抗生素的药敏性。结果显示，杆菌对大环内酯类、四环素类及氯霉素敏感，对氨基糖苷类多数表现出耐药，对头孢素类、青霉素类、β-内酰胺酶抑制剂的复合物、糖肽类抗生素表现出不同的药敏性，其实验结果与本实验结果符合。曹国文[7]的试验结果中，6株猪源乳酸杆菌对青霉素全部耐药，本实验的结果与之相符合。

通过实验，得知分离到的两株乳酸杆菌对于青霉素、氨苄西林等抗生素都产生耐药性。这些问题提醒我们在以后的兽医临床上，应尽量减少对于有耐药性或者耐药率较高的抗生素的使用，选用一些没有出现耐药性的抗生素，可以达到更好治愈疾病的目的[8]；同时，还可以为乳酸杆菌型微生态的制剂的使用提供必要的参考依据。

[1] 惠恩举.发展水貂生产市场潜力大前景好[J].特种经济动植物，2005（5）：3-4.

[2] 姚火春.兽医微生物学实验指导[M].北京：中国农业出版，2002：36-39.

[3] Gill H S. Stimulation of the immune system by lactic cultures[J]. Int Dariy J，1998 （8）：535-534.

[4] Cotter P D，Hill C. Surviving the Acid Test：Responese of Gram-Positive Bacteria to Low pH[J]. Microbiol Mol Biol Rev，2003，67 （3）：429-453.

[5] 李太元，刘伟铭，金鑫，许广波，等.健康犬肠道乳酸杆菌某些生物学特性的研究[J].吉林农业大学学报，2005，27 （6）：667-670.

[6] 李平兰，潘伟好，吕艳妮，等.微生态制剂中常用乳酸菌对抗生素的药敏性研究[J].中国农业大学学报，2004，9（1）：16-20.

[7] 曹国文，姜永康，戴荣国，等.6株猪源乳酸杆菌的分离鉴定与生物学特性研究[J].上海畜牧兽医通讯，2006，（3）：23-24.

[8] 高荣琨，王昕，李文斌，乳酸菌对鸡免疫功能的影响[J].中国动物检疫，2009，26（9）：39-40.