侵袭性泌乳素腺瘤相关基因及研究方法学进展☆

垂体腺瘤在颅内肿瘤中发病率仅低于胶质瘤和脑膜瘤，约占所有颅内肿瘤的16.7％。泌乳素（prolactin，PRL）腺瘤是最常见的功能性垂体腺瘤，约占垂体腺瘤总数的25％～41％［1］。侵袭性垂体PRL腺瘤具有侵袭性生长和高PRL分泌的特征。侵袭性垂体PRL腺瘤在发现时通常体积巨大，侵犯重要的神经、血管而难以全切，其治疗一直是困扰神经外科医生的难题之一，对垂体PRL腺瘤侵袭性的相关基因的研究将为寻找潜在的治疗靶点提供理论依据。本文拟从以下两方面综述目前侵袭性PRL腺瘤相关基因的研究进展：①与侵袭性PRL腺瘤密切相关的基因的功能及机制；②研究方法学的进展。

1 与侵袭性PRL腺瘤密切相关的基因

大量研究已证实了一些与垂体瘤侵袭性生长有关的基因，包括 Bcl-2，c-myc 等癌基因，p53、p16、Rb、nm23、PTEN 等抑癌基因，以及survivin凋亡抑制基因等。但垂体腺瘤依表达的垂体前叶激素的类型分为无激素型、GH型、ACTH型、TSH型等多种亚型，在研究上述各种基因时，并未单纯地以侵袭性PRL腺瘤为研究对象，故上述基因为多种亚型的侵袭性垂体腺瘤所共有。目前，已有明确证据表明与PRL腺瘤侵袭性密切相关的基因主要有以下几种。

1.1 Hst基因 即肝素结合分泌转化蛋白1基因（heparin secretory transforming protein 1），染色体位点上位于 11q13，其蛋白编码产物为成纤维生长因子4（fibroblast growth factor-4，FGF-4），可诱导垂体前叶血管增生，促进垂体腺瘤细胞分泌PRL。凌伟华等［2］发现 hst／FGF-4的表达在垂体 PRL腺瘤中有较高特异性，hst／FGF-4表达阳性的PRL腺瘤其侵袭性也强，机制在于以下两点：①由其产物FGF-4经自分泌或旁分泌途径发挥致癌作用；②FGF-4导致肿瘤新生血管形成，增高肿瘤组织微血管密度，致肿瘤侵袭潜能增大。

1.2 垂体瘤转化基因（pituitary tumor-transforming gene，PTTG） 该基因在染色体上的位点位于5q33，是在垂体瘤发生发展过程中发挥重要作用的一种经典的癌基因，与多种亚型的垂体瘤的发生发展均有着密切的关系，但目前关于该基因与侵袭性PRL腺瘤之间关系的研究也取得了一些进展。在侵袭性PRL腺瘤的发生发展过程中，PTTG可在雌激素诱导下过量表达，进而促进肿瘤内的血管生成，促进肿瘤的生长及侵袭。在此过程中，PTTG在雌激素介导下与碱性纤维母细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和血管内皮生长因子（VEGF）的相互诱导表达发挥了重要的作用，bFGF可调节血管生成，促进垂体腺瘤细胞的生长，从而促进垂体腺瘤的发生、发展及侵袭性的形成。此外，bFGF本身也可调节VEGF的表达［3］。Alper等［4］指出在 PRL 腺瘤中，雌激素在 bFGF 和VEGF的介导下，调节 PTTG、hst、Edpm5基因的表达来增强PRL腺瘤的侵袭性和增殖活性。因此，PTTG基因与雌激素及bFGF和VEGF等血管生长调节因子相互作用，在PRL腺瘤侵袭性发生发展过程中发挥着非常重要的作用。

1.3 Edpm5基因 即雌激素依赖性垂体瘤数量性状位点5基因（Estrogen-dependent pituitary mass quantitative trait loci 5），Pandey等［5］通过动物实验证实：在雌激素的诱导下，F344系大鼠可生长出易出血的具有侵袭性的垂体大腺瘤，而BN系大鼠则无法长出垂体腺瘤，这种差别是由一组数量性状位点决定的，Edpm5即为该组位点中的一种。其机制在于雌激素作用下，Edpm5基因在阻止PRL腺瘤的血管增生过程中发挥重要作用，进而影响PRL腺瘤侵袭性的发生与发展。目前，关于该基因的研究尚处于动物实验阶段，Edpm5基因在人垂体PRL腺瘤的血管生成和侵袭性发展过程中的作用及机制有待进一步研究。

1.4 D2R基因 即多巴胺能受体 D2基因（dopaminergic receptor-D2 gene），染色体上位点位于11q23。当前，相当一部分对于D2R基因的研究着眼于该基因表达水平对泌乳素耐药性的影响上，D2R基因低表达及mRNA交替剪接修饰致多巴胺D2受体水平下降，D2S受体亚型表达下降尤为明显，致D2受体两个异构体D2S／D2L比值下降，进而导致垂体PRL腺瘤对溴隐亭的耐药。Kelly等［6］则证实D2R基因缺失的大鼠的PRL细胞增殖明显且具有较强的侵袭性。最近，吴哲褒等［7］进一步研究了D2RmRNA异构体的表达水平与垂体PRL腺瘤生物学行为之间的关系，发现D2SmRNA的表达水平在侵袭性与非侵袭性PRL腺瘤中存在显著差异，D2SmRNA在侵袭性PRL腺瘤中呈低水平表达，并认为这一差异致使侵袭性PRL腺瘤较非侵袭性PRL腺瘤更易对多巴胺受体激动剂耐药。

1.5 CTNNB1基因 即catenin beta 1基因。早先，Qian ZR 等［8］发现，在蛋白水平，β-catenin在侵袭性垂体PRL腺瘤中的表达水平明显低于非侵袭性垂体PRL腺瘤，β-catenin为CTNNB1基因的表达产物，但最近干小强等［9］利用基因芯片技术，筛选出与PRL腺瘤相关的几种差异基因中，显示该基因在PRL腺瘤中差异表达呈上调趋势，似乎显示的是矛盾的结果，但上述两项研究却均表明该基因与侵袭性垂体PRL腺瘤的发生发展有着密切的关系，究竟该基因在侵袭性PRL腺瘤中表达情况及作用机制如何，尚有待进一步的研究。

1.6 ANGPT基因 该类基因的表达产物为血管生成素（angiopoietin）。血管生成素是一族分泌型的碱性单链多肽，是促进肿瘤血管形成的一族重要的生长因子，研究较多的有血管生成素1基因（angiopoietin 1）和血管生成素2基因（angiopoietin 2）。ANGPT1基因在染色体上位于8q23.1，其编码产物为angiopoietin 1，参与大多数恶性肿瘤包括颅内胶质瘤的血管形成与恶性进展。而在各亚型垂体腺瘤中，PRL腺瘤的血管化程度是唯一被报道与临床侵袭性有关的。干小强等［10］研究发现，呈上调表达的该基因仅与PRL腺瘤有关，而与其他亚型功能性垂体腺瘤无关；ANGPT2基因的编码产物为angiopoietin 2，angiopoietin 2通过减少细胞基质和细胞间连接的数目促进肿瘤血管的形成，进而促进肿瘤侵袭性的发展［11］。Jiang 等［12］的研究发现，ANGPT2在垂体PRL腺瘤中呈显著高表达，达正常垂体中该基因表达水平的11.7倍，进而认为该基因在PRL腺瘤的生长和侵袭性形成过程中发挥了极其重要的作用。

1.7 HMGA基因 即高迁移率族蛋白 A（High-mobility group A）基因，该基因通过可变剪接的方式编码四种蛋白，包括HMGA1a、HMGA1b、HMGA1c和HMGA2蛋白，多种人类的恶性肿瘤中都有HMGA蛋白的高水平表达。动物实验证实，过表达HMGA1基因的转基因大鼠可生长出垂体腺瘤，但该基因在人垂体腺瘤发生发展中的作用则不为人们所知。最近有学者通过测定人垂体腺瘤中HMGA1蛋白水平发现该分子的过量表达与人垂体腺瘤的生长及侵袭性的发展密切相关，该研究发现：HMGA1蛋白在侵袭性和巨大垂体腺瘤中的表达水平明显高于非侵袭性腺瘤及微腺瘤，且侵袭性程度越高，该蛋白的表达水平越高；该研究在62.5％的PRL腺瘤中测得了该蛋白的过量表达［13］，因此，可以推知编码该蛋白的HMGA基因与PRL腺瘤侵袭性生长的生物学行为存在着密切的关系，但具体机制仍有待更深入的研究。

1.8 其他初步证明与PRL腺瘤侵袭性相关但未获进一步研究的基因 新近，干小强等［9］利用基因芯片技术初步建立和分析了正常垂体与PRL腺瘤的基因表达谱，筛选出与PRL腺瘤相关的上调基因313条，下调基因856条，这些基因涉及分子结合、凋亡、代谢、信号转导、细胞周期等多个分子通路，并且发现了与PRL腺瘤侵袭性相关的结构分子及酶调控分子的表达改变，发现与可能致硬膜侵袭的胶原蛋白相关的基因如COL1A1，COL3A1，COL4A2等的表达明显下调，COL1A2，COL14A1，COL18A1等的表达平均上调3-8倍；与细胞外基质降解相关的金属蛋白酶及其抑制因子则存在一定程度的表达紊乱，如基质金属蛋白酶（MMP）-3、MMP-11和 MMP-15的表达平均上调2～10倍以上，而金属蛋白酶抑制因子-2和金属蛋白酶抑制因子-3的表达则明显下调。

必须强调的是，目前仅有少量资料证实垂体腺瘤的侵袭性生长与基因的突变或者缺失存在明确的联系，因此尚不能阐明垂体腺瘤侵袭性生长的遗传学机制，而直接的关于侵袭性PRL腺瘤相关基因的研究更是少之又少。此外，虽然许多与垂体腺瘤侵袭性相关的基因、蛋白被发现，但已发表的文献都是对垂体腺瘤直接进行研究，对照组采用整个垂体前叶甚至整个垂体的基因进行分析。由于垂体腺瘤含有多种细胞，正常垂体前叶亦为含有分泌相应激素的细胞的混合体，垂体各区域细胞功能差异显著，同一区域、核团内又拥有不同的细胞类群。事实上，不同类型的垂体腺瘤的生物学行为不尽相同，如侵袭性PRL腺瘤血管化程度很高，侵袭性GH腺瘤及侵袭性无功能腺瘤则无此特征［14］。因此，为了更精确地寻找侵袭性PRL腺瘤新的肿瘤标志物及药物作用靶点，必须阐明PRL腺瘤细胞生物学行为改变的分子机制，在此过程中需剔除其他类型垂体腺瘤细胞的干扰，从这一角度来讲，革新垂体PRL腺瘤的研究方法学显得极为重要和紧迫。

2 研究方法学的进展

2.1 PRL腺瘤肿瘤细胞异质性的解决 如前所述，当前在垂体腺瘤侵袭性的研究中，一个重要的缺陷是不加选择地对各种垂体腺瘤进行直接研究，而忽略了肿瘤细胞的异质性。缺乏功能性人类垂体细胞株是传统的垂体腺瘤科研方法上的重要缺陷之一［14］。因此，着眼于研究垂体PRL腺瘤的侵袭性时，获取纯净的PRL型肿瘤细胞及正常垂体PRL细胞是研究的关键。

目前获得纯净PRL细胞主要有以下方法：①体外细胞系培养；②免疫磁珠分选；③显微切割。相较而言，前两种方法虽然也可获得纯化的PRL细胞，但显微切割技术则是基于病理形态进行细胞纯化，较前两者可更好反映体内细胞的基因表达，并且可明显缩短操作时间、提高纯化目的细胞的准确性及保护细胞的生物信息的完整性，激光捕获显微切割技术（LCM）是目前最先进的组织纯化病理技术［15］。由于免疫组化及原位杂交等技术可特异定位目的细胞，在上述技术的辅助下，显微切割技术得到了迅速的发展。刘英超等［16］对冰冻PRL腺瘤标本及对照正常垂体进行免疫组织化学方法染色，采用4 μm紫外线激光，应用LCM技术切割腺瘤内及正常对照垂体内PRL细胞，准确、快速地分离了片状乃至单个细胞形态完好的PRL细胞，无间质细胞污染，该研究很好地解决了PRL腺瘤研究中的细胞纯化问题。

2.2 基因芯片技术的发展历程及在PRL腺瘤研究中的应用 生物芯片技术具有多靶点处理、分析速度快、所需样品少等优势，可高效、大通量筛选出新的肿瘤标志物及药物靶点，是诊治侵袭性垂体腺瘤的未来方向［14］。应用基因芯片筛查候选基因是研究肿瘤遗传学基础的一种有效方法，该技术的不断发展与进步也促进了对PRL型垂体腺瘤在基因水平的研究。E vans等［17］2008年用基因芯片和蛋白组学分析6例PRL垂体腺瘤和正常垂体的差异，发现有726个差异基因，蛋白组学研究发现4个蛋白上调，19个下调。其中notch通路的几个成分都有改变，Pit-1转录因子，生存因子BAG1表达上调，E-cadherin和N-cadherin表达下调。Evans等［18］应用基因芯片检测非分泌性和PRL、GH、ACTH分泌性垂体腺瘤的基因表达情况，发现了三种具有独特表达模式和致瘤重要性的基因，与对照组和其他肿瘤相比，叶酸盐受体基因在非功能垂体腺瘤中明显高表达，但在PRL和GH腺瘤中低表达；酪氨酸激酶基因在ACTH腺瘤中明显高表达，但在PRL腺瘤中低表达。

在基因芯片技术的发展历程中，早期的基因芯片固定的探针数量较少，且未将mRNA可变剪切（alternative splicing）考虑在内，而可变剪切调控的直接后果是一个基因产生多个不同功能的蛋白质，因此传统基因芯片技术仍缺乏准确性、全面性。外显子芯片很好地解决了上述问题，芯片上每一个探针的设计主要是参照了基因外显子簇、相关联的外显子以及转录簇的序列，并在已知的外显子序列基础上增加一些预测的外显子序列，确保了筛选的精确性。

嵌合芯片（Tiling芯片）是从全基因组范畴内入手，保证对基因组全转录本的扫描，适用于研究转录因子在基因上不同位置的定位，以及DNA甲基化、组蛋白乙酰化等。最近，新开发出的 GG-H（Glue Grant human transcriptome）芯片使用 RNA序列技术在基因水平检测出所有潜在的与所研究疾病可能有关的转录元件，继之在外显子水平对这些转录元件进行筛选，并且可以识别出编码的寡义核苷酸和未编码的转录物，此外，该芯片将探针选择区定位在外显子结合区，加强了对可变剪切的识别能力，使得临床试验中对样本RNA的数量要求明显降低，适用于大通量临床试验样本的检测［19］。

综上所述，目前对侵袭性PRL腺瘤相关基因的研究尚处于初始阶段，仍有待进一步深入的研究。新的研究手段，如免疫组化导航下激光捕获显微切割技术及基因芯片等技术的的诞生及进步将更深入地促进对于PRL型垂体腺瘤侵袭性相关基因的研究，从而在未来提供新的治疗靶点，并最终回馈于临床，提高侵袭性垂体PRL腺瘤的诊疗水平。

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