中试生产的结核DNA疫苗免疫效能研究

吴小丽 闭兰 赵亚杰 罗丹 齐建新 王炯 李忠明

近年来，结核病疫情严重，卡介苗虽然是全球使用最广泛的预防结核病的疫苗，可预防和减轻儿童的重症结核病，但对成人肺结核的保护效果不稳定［1］，因而，新型结核疫苗的研究对于预防和控制结核病具有重要意义。Mtb分泌蛋白Ag85复合物是Mtb的主要分泌性蛋白，也是Mtb主要保护性靶抗原的一部分，Ag85复合物在Mtb H37Rv株中占分泌蛋白总量的30%［2］，是一组主要的 Mtb分泌蛋白，具有分枝菌酸转移酶活性，在Mtb细胞壁合成的最后阶段发挥重要作用。将Ag85蛋白或DNA疫苗免疫动物后可诱导特异的免疫反应［3］，是新疫苗研制的热点。为了研究本所中试生产的结核DNA疫苗的免疫效能，本实验将编码Ag85A蛋白的质粒免疫小鼠，对该疫苗的免疫效能进行研究，兹报告如下。

材料和方法

一、材料

小鼠IFN－γELISA 检测试剂盒和小鼠IL－4 ELISA检测试剂盒，为北京四正柏生物科技有限公司产品；小鼠IFN－γ酶联免疫斑点检测试剂盒（ELISPOT），为Mabtech公司产品。

二、方法

1.动物分组：选取4～6周龄BALB/c小鼠，通过数字表法随机分成2组，每组10只，一组为结核DNA疫苗免疫组，一组为PBS对照组。

2.小鼠免疫：将我所300 L发酵罐中试规模生产的冻干结核DNA疫苗（结核DNA疫苗，批号090607）用灭菌生理盐水复溶，配制成1 mg/ml溶液，以每次每只100μg/100μl的剂量采用两点注射于小鼠后腿肌内进行免疫，共免疫3次，每次间隔3周。

3.样本采集：（1）血清样本采集：共采集2次血样标本，分别为免疫前眼眶采基础血及免疫结束后第3周摘眼球取血。（2）脾细胞制备：摘眼球取血，随后断颈处死小鼠，通过无菌操作取出小鼠脾脏，采用小鼠淋巴细胞分离液（达科为生物技术有限公司生产）分离淋巴细胞，通过20%FBS－RPMI1640培养基（含20%胎牛血清的RPMI 1640培养液）调整细胞浓度至1×106个/ml。

4.小鼠脾细胞IFN－γ分泌检测：采用Mabtech公司Mouse IFN－γELISPOT进行检测。（1）将调整好浓度（1×106个/ml）的细胞悬液加入各实验孔，每只小鼠12个孔，100μl/孔（4个孔一组，分别加入Ag85A、阴性对照、合成肽）；每块板设置一组质控阳性对照（4个孔，各板之间应选取同一只小鼠的淋巴细胞）、背景负对照（4个孔，加入20%FBSRPMI 1640培养基）。（2）分别加入刺激物Ag85A、20%FBS－RPMI 1640（不加刺激物）、合成肽（10μl/孔），质控阳性对照中加入刀豆蛋白A（Con A）刺激物（10μl/孔），背景负对照加入20%FBS－RPMI 1640。（3）所有样品和刺激物加完后，盖好板盖。放入37℃、5%CO2培养箱培养24 h。（4）具体检测按照试剂盒说明书进行。（5）将ELISPOT板寄往达科为生物技术有限公司（深圳实验室）进行斑点计数。

5.脾细胞CD4＋、CD8＋百分率检测：采用流式细胞术对小鼠脾细胞CD4＋、CD8＋百分率进行检测。实验同时设置免疫组小鼠脾细胞和对照组小鼠脾细胞。步骤如下：（1）将小鼠（1×106）个/ml脾细胞1 ml悬于100μl含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS中，二组同时加入FITC标记的兔抗鼠CD4抗体和PE标记的兔抗鼠CD8抗体各10μl，室温避光孵育30 min。（2）PBS洗细胞2次，加入2%甲醛固定液重悬细胞，使用流式细胞仪检测。

6.血清细胞因子（IFN－γ、IL－4）检测：（1）血清IFN－γ检测：采用北京四正柏生物科技有限公司小鼠IFN－γ酶联免疫检测试剂盒进行。①从已平衡至室温的密封袋中取出所需板条，除空白孔外，分别将血清样本（19只小鼠，每只重复2个孔，共38个孔）和不同浓度标准品 （100μl/孔）加入相应孔中，37℃湿盒孵育90 min。②洗板5次，除空白孔外，加入生物素化抗体工作液 （100μl/孔），37℃湿盒孵育60 min。③洗板5次，除空白孔外，加入酶结合物工作液 （100μl/孔），37℃湿盒孵育30 min。④洗板5次，加入显色剂100μl/孔，避光37℃湿盒孵育10～15 min。⑤加入终止液100μl/孔，混匀后5 min内酶标仪读取450 nm和630 nm吸光度值（A450/630）。（2）血清IL－4检测：采用北京四正柏生物科技有限公司小鼠IL－4酶联免疫检测试剂盒进行（方法和步骤同血清IFN－γ检测）。

7.血清抗体检测：采用间接ELISA方法对小鼠血清抗Ag85A抗体进行检测。（1）包被：用碳酸盐缓冲液将Ag85A稀释至10μg/ml，加入96孔微孔板（深圳金灿华实业有限公司生产）每孔100μl，放4℃湿盒过夜。（2）封闭：弃包被液，用含5/104吐温－20的磷酸盐缓冲液（PBST）洗板5遍，用纱布拍干。每孔加1%BSA 200μl，置37℃湿盒2 h。封闭好的96孔微孔板烘干后置4℃冰箱内，1周内使用。（3）加样：将每只小鼠免疫前后采集的血清按确定的稀释倍数1∶10稀释（稀释液为1%BSA）；100μl/孔，置于37℃湿盒，温育60 min。（4）加酶结合物：PBST洗板5遍，用纱布拍干。用抗体稀释液将辣根过氧化酶标记的羊抗大鼠免疫球蛋白G（HRP－GAM IgG）稀释至1∶20 000，加入96孔微孔板，每孔100μl，置于37℃湿盒，温育30 min。（5）显色：PBST洗板5遍，用纱布拍干。先加入底物A液显色（成分是：NaAc·3H2O 9.185 g，柠檬酸1.576 g，过氧化脲0.45 g，加双蒸水溶解后稀释至750 ml，调p H值至5.0～5.5），每孔50μl，再加入底物B液显色，每孔50μl，置37℃反应10 min后，每孔加入2 mol/L硫酸50μl终止显色。（6）读数：终止反应后30 min内，酶标阅读仪测定A450和A630值，A450减去A630，以行校对。

8.数据分析：对于脾细胞CD4＋、CD8＋百分率和血清细胞因子IFN－γ、IL－4水平测定结果采用t检验比较；脾细胞特异性IFN－γ分泌水平采用SPSS 11.0软件进行单因素方差分析，比较两组之间的差异，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、细胞免疫相关因子检测

1.小鼠脾细胞IFN－γ分泌检测：根据读板结果，独立样本t检验显示：t＝36.538，P＝0.018，结核DNA疫苗免疫组分泌IFN－γ细胞个数（103.6±112.14）高于PBS对照组（5.78±5.83），差异有统计学意义（t＝36.538，P＝0.018）（表1）。

2.脾细胞CD4＋、CD8＋百分率检测：流式细胞仪检测结果表明，结核DNA疫苗免疫组CD4＋细胞百分率均值为21.57%，高于PBS对照组12.17%，两者比较差异有统计学意义（t＝3.043，P＝0.038）；结核DNA疫苗免疫组CD8＋细胞百分率均值（13.70%）和 PBS对照组（10.57%）差异无统计学意义（t＝0.847，P＝0.445）。

3.血清细胞因子（IFN－γ、IL－4）检测：（1）血清IFN－γ水平检测：每只小鼠血样设复孔，求其重复的两孔均值（表2）。结核DNA疫苗免疫组IFN－γ水平 ［（129.6±159.0）pg/ml］高 于 PBS 对 照 组［（76.5±21.5）pg/ml］，但差异无统计学意义（t＝－1.047，P＝0.309）。（2）血清IL－4水平检测：每只小鼠血样设复孔，求其重复的两孔均值（表3）。结核DNA 疫苗免疫组IL－4水平［（146.2±34.3）pg/ml］低于PBS对照组（177.7±28.1），差异有统计学意义（t＝2.244，P＝0.038）。（3）血清抗体检测：将各组免疫前后血清中特异性抗Ag85A抗体通过ELISA检测吸光度值，并用Excel软件制图（图1），从图中可以看出A 值均小于0.2，免疫前后、免疫组与对照组抗体水平从免疫学角度讲均无免疫学意义。

表1 不同编号小鼠在两组中采用读板机对ELISPOT读取的斑点数（个）

表2 PBS对照组和结核DNA疫苗免疫组IFN－γ水平的检测结果（pg/ml）

表3 PBS对照组和结核DNA疫苗免疫组IL－4水平检测结果（pg/ml）

图1 小鼠血清特异性抗体检测结果

讨 论

对于新型疫苗的评价，一般是从两个方面进行的［4－5］，一个是免疫学指标的变化，包括抗体水平的变化，免疫细胞水平的变化等；另一个是流行病学指标，即现场调查，包括新型疫苗对发病率、病死率的影响，发病后症状减轻的程度等。本实验旨在对武汉生物制品研究所研制的结核核酸疫苗进行初步效果评价，所以只观察疫苗对正常动物免疫学指标的影响。机体的抗结核病免疫反应是个非常复杂的过程，到目前为止对其确切机制仍然不甚明了［6］。因此，在疫苗评价时，缺乏公认的免疫学指标。但是，一般认为，结核病免疫机制主要是T细胞介导的细胞免疫［7］，包括CD4＋T细胞和CD8＋T细胞的效应，笔者采用流式细胞术检测结核核酸疫苗对外周免疫器官（脾）T细胞亚群的影响。CD4＋Th1细胞介导的，以巨噬细胞为效应细胞的细胞免疫在抗结核免疫中处于中心地位［8－9］，CD4＋Th1通过释放IFN－γ等细胞因子活化巨噬细胞进而清除细胞内外的Mtb；虽然CD4＋Th2通过产生IL－4等细胞因子促进B细胞的增殖分化，产生针对Mtb抗原的抗体，但是这些抗体在机体的抗结核免疫中无保护作用［10］。所以，笔者以动物外周血和外周免疫器官（脾）中IFN－γ水平的变化间接监测CD4＋T细胞是否向Th1分化，以外周血中IL－4水平变化间接监测CD4＋T细胞是否向Th2分化，进而明确疫苗免疫后动物体免疫应答的方向。从流式细胞术检测的结果可以看到，结核DNA疫苗免疫组CD4＋细胞百分率高于阴性对照组（P＜0.05），而CD8＋细胞百分率差异无统计学意义（P＞0.05），说明结核DNA疫苗主要引起Th1细胞的效应。诱导CD4＋Th1细胞反应，可以加强巨噬细胞对Mtb的杀伤作用，但进一步验证需要在有资质的生物安全三级实验室进行豚鼠动物模型攻毒实验。从ELISA检测结果可知，在结核DNA疫苗免疫组免疫前后外周血抗Ag85A抗体水平没有明显变化。Ag85蛋白能够诱导机体产生较强的T细胞增殖和刺激机体产生大量的INF－γ［12］，用 Ag85免疫的小鼠能够抵抗 Mtb的攻击，在感染过Mtb的人的血清中也可以测到含量较高的Ag85的抗体［13］，但是，本实验从Ag85抗体的结果来看，没有刺激产生抗体，可能是免疫程序和采血时间差异造成的；究竟多少剂量和怎样的免疫程序能到达最好的效果，有待于在以后的试验中进一步进行摸索。

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