结核分枝杆菌thy A基因突变与对氨基水杨酸钠耐药关系的研究

孙勇 洪峰 许绍发 邢青 刘毅 任卫聪 孙照刚 高铁杰 张治国 易俊莉 王甦民 李传友

目前，结核病仍是最常见的传染病之一，全世界约有2亿人感染Mtb，其中仅2010年新增880万患者，140万人死于结核病［1］。近年来，由于不合理的用药及新药研发的缓慢导致 MDR－TB（至少对INH、RFP耐药的结核病）患者的增多及结核病防控的困难。2010年我国结核患者中有5.4%为MDR－TB患者［1］。由于Mtb对一线药物的耐药，人们开始更多关注二线抗结核药物，并与一线抗结核药联合应用，但随着应用的二线药物如氟喹诺酮类药物、卡那霉素、卷曲霉素等耐药出现，人们又开始寻找那些对Mtb有抑制或杀灭作用而应用不是很广泛的药物，其中对氨基水杨酸钠（PAS）是重要的二线抗结核病药物之一，但对其作用机制及耐药机制尚不十分清楚。

PAS对Mtb有抑制作用，一般认为PAS与对氨基苯甲酸（PABA）近似，通过对叶酸合成的竞争抑制作用而抑制 Mtb的生长繁殖［2］。Rengarajan等［2］在卡介苗菌株中利用转座子插入的方法，发现编码胸苷酸合成酶 （thymidylate synthase，thy A）的基因突变抑制了酶的活性导致细胞内叶酸水平的下降，其认为thy A基因突变不仅导致PAS耐药而且还是其他和叶酸代谢相关药物的靶点。Ratledge等［3］认为PAS抑制了 Mtb对铁离子的吸收，从而导致Mtb生长受限及毒力的减弱。由于PAS不是临床首选药，应用的相对较少，对其耐药的研究更少，目前认为thy A基因的突变导致了PAS耐药［2］。笔者通过全基因测序测定thy A基因，了解65株PAS敏感菌株和31株PAS耐药菌株thy A基因突变情况，分析了PAS耐药与thy A基因突变的关系，探讨PAS耐药分子机制，为建立快速耐药检测方法及指导临床医生合理用药提供科学依据。

材料和方法

一、材料

1.临床菌株来源：本实验所用北京地区96株Mtb临床分离株来源于2008—2010年北京市结核病控制研究所和北京市昌平区结核病防治所，采集的痰标本按照《结核病诊断实验室检验规程》［4］进行Mtb的培养、菌种鉴定，采用比例法测定药物敏感实验。标准菌株H37Rv（ATCC25618）为本室保存。

2.主要仪器设备：Bio－rad S1000基因扩增仪（美国Bio－rad公司），Fo ToDYNE凝胶成像系统（美国Image公司），Nanodrop2000核酸分析仪（美国Thermo公司），ESCOⅡ生物安全柜（新加坡ESCO公司）。

二、方法

1.细菌基因组DNA的抽提：采用酚/氯仿抽提的方法［5］。

2.PCR 扩增：Primier 5.0设计引物，上游5′GGTGTCGGTGGTTTTCGGCAT3′， 下 游 5′TCAGCCCCACCATCGTCACAC3′，扩 增 全 长1060 bp，其中包含thy A基因（792 bp）。采用50μl体系，包括2×pfu DNA聚合酶（北京Generay公司）25μl，上下游引物各0.4μmol/L，1μl模板，双蒸水22μl。反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，62℃退火40 s，72℃延伸2.3 min，最后72℃延伸5 min，35个循环。

3.PCR纯化：PCR产物置1%琼脂糖凝胶中电泳，用DNA凝胶回收试剂盒（杭州Axygen公司）回收DNA扩增片段，分别送北京擎科新业和北京金唯智生物科技公司测序。H37Rv的标准序列来自结 核 数 据 库 网 站［6］。 采 用 DNAMAN Version 5.2.2软件进行序列比对。

三、统计学分析

数据采用SPSS 10.0进行统计分析，组间比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、Mtb培养、鉴定及药物敏感性实验结果

分离得到96株痰培养阳性菌株并进行鉴定和药物敏感性实验。全部鉴定为Mtb，耐PAS菌株31株（32.29%），敏感菌株65株（67.71%），耐药与敏感菌株的患者男性与女性差异无统计学意义（χ2＝0.381，P＞0.05）；初治患者中耐药与敏感菌株分别达到了70.97%、86.15%，但两者差异无统计学意义（χ2＝3.177，P＞0.05）；同时北京常驻人口与外地流动人员相比较耐药与敏感菌株差异无统计学意义（χ2＝0.037，P＞0.05）（表1）。

表1 96株Mtb对PAS的药物敏感性实验结果 ［株（构成比，%）］

二、PCR扩增结果

96株Mtb经PCR扩增，在1000 bp左右均扩增出清晰条带，部分结果见图1。经凝胶回收对PCR产物进行纯化，经测序比对后证实包含thy A基因片段。

图1 thy A基因扩增片段电泳结果

三、序列测定的分析结果

以Mtb标准株H37Rv序列为对照对测序结果进行分析，发现突变类型包括单碱基缺失、碱基的插入、碱基突变。其中以第19位碱基C缺失和第168位碱基C缺失突变为主，在耐药菌株中的突变率分别是54.84%（17/31）、25.81%（8/31，包括联合其他位点突变株），但其敏感菌株中突变也达了35.39%（23/65），12.31%（8/65），耐药与敏感相比两个位点突变差异均无统计学意义（χ2＝3.268、2.754，P＞0.05）。在31株PAS耐药菌株中19位缺失C单突变9株、其联合168位缺失C突变4株，168位缺失C单突变2株，此外188位缺失T突变2株，5株多位点突变均为1株，其余9株（29.03%）耐PAS菌株thy A基因未发生突变；敏感菌中19位缺失C突变最多15株，其联合168位缺失C突变4株、联合16位缺失G突变2株、联合16位缺失G和168位缺失C突变2株，其余突变各1株，此外，PAS敏感菌株中有30株（46.15%）thy A基因发生突变（表2）。

讨 论

PAS是最早被使用的抗结核药之一［7］。尽管发现其对Mtb有抑菌作用，但因其具有肠道不良反应及肝肾损伤，应用的不是很广泛，并没有列入常规化疗药物。但随着大量MDR－TB及常规使用的二线药物的耐药出现，PAS又重新被使用。PAS的研究很少，对PAS耐药的研究更少。Rengarajan等［2］利用转座子插入的方法在卡介苗中证实了PAS的耐药和基因thy A的突变有关，随后他们在8株PAS耐药临床菌株中发现有3株菌thy A基因发生突变，其中2株第202位的苏氨酸被丙氨酸替换（T202A）、1株第222位精氨酸置换为甘氨酸（R222G），而10株敏感菌株没有突变。Mathys等［8］随后分析了118株Mtb与叶酸代谢相关的6个基因thy A、dfr A、fol C、fol P1、fol P2、thy X 和 N－乙酰基转移酶相关的3个基因nho A、aac（1）、aac（2），他们研究表明dfr A、fol P1、fol P2、thy X 基因的突变和PAS耐药无关，而fol C、nho A、aac（1）、aac（2）4个基因没有发现多态性位点，仅thy A基因突变导致了PAS耐药。其中37%PAS耐药菌株thy A基因发生了突变，主要的突变位点是T202A。

表2 31株PAS耐药菌株和65株PAS敏感菌株thy A基因突变情况 ［株（构成比，%）］

本研究中经培养、药敏实验鉴定的31例PAS耐药菌株和65例PAS敏感菌株，在性别、治疗情况、地域上差异均没有统计学意义。其中患者主要以男性初治患者居多，北京市户籍人口和流动人口患者基本持平。针对其thy A基因测序发现，有22（70.97%）株耐药菌株thy A基因发生突变，而敏感菌株中也有30（46.15%）株突变，两者差异有统计学意义（χ2＝5.206，P＜0.05）。而突变主要以19位缺失C、168位缺失C为主，但敏感菌株和耐药菌株之间差异却没有统计学意义，提示突变位点可能是thy A基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）位点，突变位点可能与PAS耐药无关。本研究的thy A基因SNP位点与之前研究［8－9］并不吻合，表明thy A 基因突变的复杂多变。而此前认为突变热点的T202A［8］，本研究并没有发现。因地域或菌株表型的差异，可能其thy A基因突变位点也不同。Feuerriegel等［10］也认为thy A基因T202A突变位点并不是PAS耐药标志，可能是拉美地中海型菌株特异性突变位点。

本研究数据显示PAS耐药菌株与敏感菌株thy A基因突变位点差异没有统计学意义，PAS耐药菌株中高达70.97%的菌株发生了thy A基因突变，因此thy A基因突变可能PAS耐药的靶点，但本研究中并没有发现特异性的耐药突变位点。此前国内张宗德等［9］研究也发现thy A基因突变位点比较分散，没有突变热点，因此thy A基因突变是否与PAS耐药相关一直是研究的热点之一。国外的体外实验研究证实了基因thy A的突变和PAS的耐药相 关［2］。Fivian－Hughes 等［11］在 体 内 研 究 证 实thy X基因同样编码胸苷酸合成酶，在thy A基因敲除菌中，胸苷酸合成酶活性没有降低Mtb生长并未受影响，推测是thy X基因编码胸苷酸合成酶使其保持正常的水平。他们的研究还表明thy A基因的缺失和PAS的耐药相关。Ulmer等［12］和 Hunter等［13］研究表明thy A、thy X基因可能是潜在的药物靶点。而Rengarajan等［2］认为thy X基因突变并没有导致PAS耐药。不同的研究显示thy A或thy X基因均可能与PAS耐药相关。

本研究分析了北京地区的31株PAS耐药菌株和65株PAS敏感菌株thy A基因突变情况，耐药和敏感菌株thy A基因的突变比例较高，但并没发现与PAS耐药相关的特异性位点，可能与所选样本较少有关，也可能存在其他耐药机制，因此还需进一步大样本的深入研究。研究thy A基因与PAS耐药的关系，不仅能研究PAS耐药机制、更好地指导临床用药，而且有助于建立快速、准确的耐药分子鉴定方法。

［1］World Health Organization.（2011）Global tuberculosis control：WHO report 2011.Geneva：Switzerland［2011－12－24］.http：//www.who.int/tb/publications/global＿report/2011/gtbr11＿full.pdf.

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