RP－HPLC法测定香莲霜中丁香酚含量

吴钉红，吴秀英，郑少文，袁小红＊

（1.广东省中医院，广东 广州 510120；2.广州中医药大学，广东 广州 510380）

香莲霜为广东省中医院新开发的医院制剂，含有丁香、广藿香、黄连等中药材，具有清热燥湿、杀虫止痒的功效，临床用于治疗皮肤真菌病、外阴阴道念珠菌病和细菌、滴虫性阴道炎。丁香是该制剂中的君药，有效成分丁香酚具有抑菌消炎、除臭、防腐抗病毒、清热解暑、镇痛、抗惊厥的作用［1］。现代医学研究证明，丁香还是一种广谱抗菌药［2］。本实验选择丁香酚为指标成分，采用反相高效液相色谱法进行含量测定，确定该霜剂中丁香酚的含量。通过实验选择合适的色谱条件使丁香酚跟其他成分和基质分离开来，通过样品回收率考察该方法的可行性。为该制剂的质量控制提供实验依据，确保该制剂的安全有效。

1 实验材料

1.1 实验仪器

高效液相色谱仪（waters，含600型液相色谱泵，2998PAD检测器，Empower色谱工作站）；C18色谱柱（diamonsil，250mm×4.6mm ，5μm）；电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司，BS224S）。

1.2 实验试药

丁香酚对照品（批号：725－202929，中国药品生物制品检定所）；香莲霜（医院制剂，批号：20100126、2010022201、2010022202、2010031201、20100311、2010031202、20100305、2010031001、20101203、20100313）。试药：本实验除高效液相所用甲醇、乙腈为色谱纯、水为高纯水，其他试剂均为分析纯。

2 实验方法及结果

2.1 对照品溶液的制备

取丁香酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含丁香酚0.273mg的溶液，作为对照品储备液。

2.2 供试品溶液的制备

取本品1g，精密称定，置于100mL的具塞锥型瓶中，精密加无水乙醇50mL，称定重量，超声提取20min，放置常温后，置于2℃～10℃的冰箱中，放置过夜。第2天取出，放置常温，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45μm的微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。

2.3 色谱条件［3］

色谱柱为C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为甲醇－水（70∶30）；流速为1.0mL·min－1；检测波长为280nm；进样量10μL。此条件下丁香酚与其他组分达到基线分离，分离度R＞1.5，理论板数按丁香酚计算均大于3000。丁香酚保留时间约8min。

2.4 线性关系考察

取0.273mg／mL的丁香酚对照品溶液，连续进样5次，分别进样1.0、5.0、10.0、20.0、40.0μL，按上文所述色谱条件操作，记录色谱图和峰面积。以峰面积积分值A为纵坐标，对照品进样量C（μg）为横坐标，进行回归分析，得到回归方程：Y＝1262482.39X－11937.64，r＝0.9999。结果表明丁香酚在0.027328～1.09312μg／mL范围内进样量与峰面积呈良好的线性关系，线性曲线基本上过原点，可用外标法进行测定和计算。

2.5 精密度试验

取对照品溶液各10μL，重复进样5次，按前文所述色谱条件操作，计算丁香酚峰面积的相对标准偏差，RSD＝0.21%，表明精密度较好。

2.6 稳定性试验

取样品溶液，分别在0、2 、4、8、12、24h进样，测定峰面积，计算丁香酚峰面积的相对标准偏差，RSD＝0.47%。表明用本方法处理的溶液在室温放置24h稳定。

2.7 重现性试验

精密称取同一批号的5份样品，照“2.2”项下的制备方法，进行操作测定，计算丁香酚含量及相对标准偏差，香莲霜中丁香酚的平均含量为4.2006mg／g，RSD＝0.31%，表明方法重现性较好。

2.8 加样回收率试验

精密量取已知丁香酚含量的样品（4.2006mg／mL）6份，再分别精密加入一定量的对照品，按样品测定项下操作，依法测定，计算回收率，平均回收率为96.16，RSD＝1.47%，表明方法回收率较好。结果见表1。

表1 丁香酚加样回收率试验结果

2.9 专属性实验

按处方制备缺丁香的阴性对照样品，照供试品溶液的处理方法制备阴性供试品溶液。对照品溶液、供试品溶液、阴性供试品溶液连续进样各10μL，按上述色谱条件测定。结果表明阴性供试品溶液在丁香酚色谱峰位置处无相应峰出现，表明在此色谱条件下，其它药材及辅料对样品含量测定无影响。

图1 高效液相色谱

2.10 含量测定

精密称取10个批号的香莲霜各1g，按“2.3”项下的制备方法，分别进行处理，精密吸取供试品溶液各10μL，依法测定，以峰面积按外标法计算样品中丁香酚的含量。结果见表2。

表2 香莲霜中丁香酚含量测定结果

3 讨论

取丁香酚对照品溶液，在200～400nm范围内进行波长扫描，结果在280nm波长处有最大吸收，与文献报道相符［4，5］，故选择280nm 作为测定波长。

图2 丁香酚对照品紫外光谱

用70%甲醇作为提取溶剂，色谱峰出现拖尾，峰形较宽，理论塔板数低。而用无水乙醇作为提取溶剂，色谱峰峰形好，理论塔板数高，故选用无水乙醇为溶媒。同时比较了索式提取、超声提取、回流提取三种提取方法，结果表明，用无水乙醇超声提取20min效果最佳。

结果表明，本研究建立的反相高效液相含量测定方法，简单快速，精密度高，稳定性较好，专属性强，结果准确可靠，可以用于香莲霜中丁香酚的含量测定。

［1］RIE W，KEUNG WM.Rhizoma acori graminei and its active principles protect PC－12cells from the toxic effect of amyloidbeta peptide［J］.Brain Res，2003，963（1－2）：282－289.

［2］KIM HM，LEE EH，HONG SH，et al.Effect of Syzygium aromaticum extract on immediate hypersensitivity in rats［J］.J Ethnopharmacol，1998，60（2）：125－131.

［3］国家药典委员会.中国药典高效液相色谱图集［M］.北京：人民卫生出版社，2005：140.

［4］余小平.高效液相色谱法测定丁香中丁香酚的含量［J］.药物分析杂志，2008，28（6）：975－976.

［5］张少彦，饶华孟.高效液相色谱法测定丁硼乳膏中丁香酚的含量［J］.海峡药学，2009，21（10）：41－42.