MRE11基因在食管鳞癌中的表达

刘青松 朱兴春 张均 袁国华 罗雄燕 杨明辉 唐中

(1.川北医学院医学检验系; 2.川北医学院附属医院检验科; 3.川北医学院附属医院风湿免疫研究所 四川南充 637000)

食管癌是全世界常见的恶性肿瘤之一。染色体基因不稳定是人类肿瘤发生发展的中心环节,而端粒通过保护染色体的完整性而维持基因组的稳定性。端粒异常可激活毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白(ATM)和共济失调毛细血管扩张症Rad3相关蛋白激酶(ATR)依赖的DNA损伤反应途径导致DNA双链断裂(DSBs),并促进失去功能的端粒非同源末端融合(NHEJ)[1]。由MRE11、Rad50和Nijmegen断裂综合症蛋白(Nbsl)组成的MRN复合物对DSBs和NHEJ具有保护作用[2]。MRE11具有DNA结合、双链DNA3’-5’外切酶和单链DNA结构特异性内切酶活性等功能,这些功能对于DNA末端封闭而防止DNA末端结构融解是必需的。因此研究Mre11对于食管癌的发生机制的深入理解具有重要意义。为此,本文旨在通过实时荧光定量PCR方法检测Mre11 mRNA在食管癌组织中的表达。

表1 定量PCR的基因引物序列

图1 MRE11 PCR产物电泳图

图2 MRE11 PCR产物溶解曲线图

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 对象 收集2009年5月至2010年12月在川北医学院附属医院手术的食管癌中心组织和癌旁组织22例。所有患者均为汉族人,其中男性21例,女性1例,年龄42～74岁,平均年龄62岁。所有病例通过病理组织细胞形态学加以确诊。所有标本储存在用DEPC水处理的EP管中,-80℃低温保存备用。同时详细记录食管癌相关记录,如性别、年龄、病理分型、临床分期、肿瘤大小等相关信息。其中临床分期标准为:T1肿瘤侵犯粘膜或粘膜下层,T2肿瘤侵犯肌层,T3肿瘤侵犯外膜,T4肿瘤侵犯邻近结构。

1.1.2 器材与试剂 本研究涉及主要器材与试剂包括:Trizol(天根);逆转录试剂盒(成都博瑞克);PCR试剂(天根,2×Taq PCR Master Mix);定量PCR试剂(ABGAB); PCR仪(BIO-RAD Mycycler);定量PCR仪(ABI 7900HT);凝胶成像仪(BIO-RAD);紫外分光光度计(岛津,UV-2550)。

表2 MRE11基因在食管鳞癌组织中的表达(±s)

表2 MRE11基因在食管鳞癌组织中的表达(±s)

组别 例数 MRE11 t P癌中心组织22 0.14±0.12 2.90 0.006癌旁组织 21 0.29±0.22

1.2 方法

1.2.1 RNA抽提和逆转录 (1)总RNA抽提与cDNA链合成:剪取约100mg组织放入陶瓷碾钵中,加液氮进行碾磨成粉末,然后加Trizol试剂1mL,继续碾磨。将碾磨液转入1.5mL的Ep管,提取总RNA,取2μL总RNA溶于48μL经DEPC处理的水中,用紫外分光光度计测定其A260/A280值,检测其纯度和浓度。按每20μL体积加2μg RNA比例,依照逆转录试剂盒说明书操作合成cDNA。(2)实时定量PCR:MRE11和内参APL13A引物由上海Sangon公司合成,序列见表1。PCR反应体系总体积为20μL,各反应参数如下:2.5 Master mix 9μL;上下游引物(10μmol/L)各0.25μL,cDNA 1μL。反应条件:经50℃ 2min热启动和95℃5min变性后,反应体系再经40个循环的95℃ 15sec,60℃ 1min反应,并在此循环过程中收集荧光信号。同时设立无模板对照监控反应进程。在实验结束后进行溶解曲线分析,以鉴定产物是否单一,确保结果的准确性。(3)统计方法:数据采用SPSS10.0 for windows做Explore正态性分析,MRE11的表达呈正态分布,因此其表达量用(±s)表示,并进行独立样本t检验,以P<0.05为显著差异。

2 结果

2.1 MRE11基因PCR产物分析

在进行定量PCR前,我们采用普通逆转录PCR对MRE11基因进行了分析,以鉴定MRE11基因引物的是否可扩增出特异性MRE11基因。电泳结果显示,该引物不仅能得到单一的PCR条带,而且引物二聚体含量极低(图1)。说明该引物可用于基于SBRY-Green荧光染料的实时荧光定量PCR分析。

在定量PCR反应结束后,我们立即对产物进行解离曲线分析。发现在MRE11基因PCR产物理论TM值(84℃)出有单一峰值出现(实测值为81.5℃),且在其他温度下无峰出现(图2)。说明我们得到的数据为MRE11基因的真实反应,可用于下一步分析。

2.2 MRE11在食管鳞癌组织中的表达

我们检测了22例食管鳞癌组织及其相应癌旁组织MRE11基因的表达。其中22例癌组织中均得到相应信号,但癌旁组织有1例没有检测到荧光信号。因此我们对22例癌组织标本和21例癌旁组织标本MRE11基因的表达进行了分析。与癌旁组织相比,癌组织中的MRE11基因表达显著降低,具有统计学意义(P=0.006)(表2)。

2.3 MRE11 mRNA表达与食管鳞癌临床病理关系

为了明确MRE11的表达在食管鳞癌的发生发展中的意义,我们对其表达与食管鳞癌的临床病理进行了进一步分析。结果发现,MRE11 mRNA的表达与年龄、分化程度、有无淋巴结转移以及有无吸烟、饮酒史均无关,但与临床分期和肿瘤生长速度有关。数据显示,T1和T2期患者的MRE11 mRNA的表达显著低于T3和T4期患者(P=0.000),肿瘤生长较慢的患者MRE11 mRNA的表达也低于生长较快的患者(P=0.012)。

3 讨论

有研究发现,食管鳞癌存在很高的染色体畸变率[3]。染色体畸变引起的染色体基因组不稳定是人类肿瘤发生发展的中心环节,维持适当的端粒是全基因组稳定的关键。哺乳动物端粒由TTAGGG重复片段组成,并与端粒保护蛋白复合体(shelterin)结合。端粒的磨损或shelterin脱帽可引起DNA损伤反应和无功能端粒末端融合[4],从而导致基因组DNA的不稳定性。DNA损伤反应是一个包含信号转导、细胞周期调节和DNA修复的功能网络。由MRE11组成的MRN复合物是DNA损伤反应的关键调节复合物。研究表明,MRN复合物在维持端粒、细胞周期检查点信号系统、DNA复制和DSBs过程都是必需的[5]。

MRN复合物作为DNA DSBs的感应元件,位于断裂位点并重征ATM[5]。MRE11是MRN复合物的重要成员之一,具有DNA结合、双链DNA3’-5’外切酶和单链DNA结构特异性内切酶活性等功能。Deng[1]等研究表明,MRN复合物是细胞传感端粒酶异常的物质,MRE11核酸酶的活性可能导致端粒3’端失去融合染色体的能力。当MRN复合物感应有端粒磨损,端粒保护功能丧失时,MRE11核酸酶活性在3’端端粒悬凸消除,从而促进端粒融合,导致染色体基因组不稳定性。此外,MRE11还能保护端粒重复片段。结果表明,MRE11 mRNA在食管鳞癌组织中的表达相比癌旁组织显著降低。可见,MRE11降低可能是食管鳞癌发生的重要内因。

进一步分析MRE11 mRNA和食管鳞癌临床病理特征关系时发现,MRE11 mRNA在食管鳞癌组织中的表达与年龄、分化程度、有无淋巴结转移以及有无吸烟、饮酒史均无关,但与临床分期和肿瘤生长速度有关。结果表明,在临床分期较低患者(T1和T2期)MRE11 mRNA的表达显著低于临床分期较高(T3和T4期)患者,肿瘤生长较慢的患者MRE11 mRNA的表达也低于生长较快的患者。这可能是因为MRE11表达的降低影响MRN复合物形成,导致细胞周期检查点信号系统紊乱,从而影响肿瘤细胞的生长速度。总之,我们的实验结果表明,不管在食管鳞癌的发生,还是在食管鳞癌的生长发展过程,MRE11均具有重要作用。

[1] Deng YB,Guo XL,Ferguson DO,et al.Multiple roles for MRE11 at uncapped telomeres[J].Nature,2009,460(7257):914～918.

[2] Yang YG,Saidi A, Frappart PO,et al. Conditional deletion of Nbs1 in murine cells reveals its role in branching repair pathways of DNA double-strand breaks[J].EMBO J, 2006,25(23):5527～5538.

[3] 康维,姚汉清,房丽丽.食管鳞癌3、8、10、20和Y染色体的非整倍性分析[J].遗传,2009,31(3):255～260.

[4] Palm W,de Lange T. How shelterin protects mammalian telomeres[J].Annu Rev Genet,2008,42:301～334.

[5] Yoshihiko M, Hiroshi S, and Masaru M.Molecular mechanisms of esophageal squamous cell carcinogenesis: clues to improve treatment outcomes [J].Ann Thorac Cardiovasc Surg,2010,16(6):387～388.