LPS诱发sAPP-α转基因鼠神经细胞损伤机制的初步探讨

王 政 韩玉霞 苏 刚 陈迪祥 肖元宏 (中国人民解放军总医院小儿外科，北京100853)

小儿孤独症(Autism)，又称小儿自闭症，是一类以严重孤独、缺乏情感反应、语言发育障碍、刻板重复动作和对环境奇特反应为特征的疾病，在美国的发病率为万分之14.9。根据全世界的统计，小儿孤独症的发病率大约为万分之五，以中国目前现有的总人口数量来估计，有五十万左右的孤独症患者［1］。目前，对小儿孤独症并无特效治疗，因此对于发病机制的研究，将为该病的有效治疗提供理论依据。

小儿孤独症的发病机制非常复杂：大量资料提示本病与遗传有关;也有研究发现与大脑器质性损害有关;还有研究者认为疫苗免疫所引发的免疫损伤是造小儿孤独症发病的元凶。Sokol和他的同事研究发现，孤独症患儿体内sAPP-α含量是正常儿童的两倍，推测淀粉样前蛋白(Amyloid precursor protein，APP)在孤独症患儿体内更多以α切割形成sAPP-α为主，而非传统上 β、γ切割形成Aβ肽段(Amyloid beta)［2］。

sAPP-α转基因小鼠体内过表达 sAPP-α，模拟一种基因突变可能导致的小儿孤独症。对该小鼠的行为学、症状学分析表明，该小鼠模型在正常状态下并不会自动发展为孤独症。本研究使用格兰阴性细菌的主要毒力因子LPS感染小鼠，验证感染是否是促进该类型小鼠发展成为孤独症的始动因素。低剂量LPS注射sAPP-α转基因小鼠、严格对照小鼠，对小鼠体内相关指标，尤其是大脑内病理改变进行比较、分析。研究结果表明，代表着有可能发展成为小儿孤独症的sAPP-α转基因小鼠，即使在低剂量LPS注射后，也出现了严重的神经系统损害，推测这种神经系统的损害是促发孤独症发病的因素之一。

1 材料与方法

1.1动物和试剂 以C57BL/6为背景的转基因小鼠sAPPα-Tg小鼠由本实验室从国外引进，于我院基础研究所动物房养殖，所有的动物实验均按照我院动物使用方法和规则进行。出生后3周小鼠被选择作为实验对象，该时期小鼠神经系统已经发育完全。小鼠注射使用的LPS购买自Sigma公司，PBS重悬粉剂LPS，并调节到所需要的浓度，即用即配。50 μg LPS注射后，每天称重小鼠直至20天。

1.2动物实验样品的准备 50 μg LPS注射小鼠后于不同时间点收获，封闭容器内乙醚对小鼠进行麻醉后，心脏取血进行外周血细胞计数检测，分离血浆，-80°C储存备用。20 ml预冷PBS灌注心脏后，分离小鼠大脑，右侧大脑半球迅速于干冰中冻存保留，用于匀浆并提取上清，进行炎症因子检测;左侧大脑半球分离放置于4%的福尔马林中过夜，后放置于梯度蔗糖液中脱水，蔗糖浓度依次为10%、20%、30%，且分别保存于4°C过夜。-20°C冰冻切片机将样品切成25 μm或者40 μm附着于载玻片上的切片，一部分切片以悬浮形式保存于含有100 mmol/L叠氮化钠的PBS 24孔板中，4°C保存。

1.3组织化学 大脑切片于1%Thioflavin S(ThioS，Sigma)在含有70%的乙醇溶液中孵育5分钟，蒸馏水漂洗大脑切片2次，使用含有4＇，6＇-diamidino-2-phenylindole(DAPI，Vector Laboratories) 的荧光固定培养基进行固定。Nissl染色用于检测神经细胞的外形结构，主要检测神经细胞发育畸形。简单来说，漂浮大脑切片被固定在载玻片上，空气中干燥后于1∶1酒精与氯仿中过夜孵育。然后，大脑切片使用梯度酒精溶液进行脱水，0.1% 甲酚紫溶液染色5～10分钟。蒸馏水漂洗后于95%酒精中干燥脱水，固定培养基进行固定，按照文献［3］方法进行Cogo红染色。

1.4免疫组织化学 大脑切片使用各种标记神经细胞的抗体进行标记，包括大鼠抗小鼠 CD11b(1∶1 000;Serotec)、FITC标记的豚鼠抗仓鼠CD40(1∶100;BD Biosciences Pharmingen)、兔抗小鼠钙离子结合适配器分子1(Ionized calcium binding adaptor molecule 1)(Iba1)(1∶1 000;Wako Pure Chemicals)、仓鼠抗小鼠 CD11c(1∶50;Pierce)、大鼠抗小鼠趋化因子受体(Chemokine receptor)Ccr2(1∶100;Novus Biologicals)、小鼠抗人 Aβ(clones 4G8 or 6E10;1∶500;Covance)、小鼠 anti-NeuN(1∶3 000;Millipore);然后将已经经过一抗染色的大脑切片使用相应的Alexa Fluor 488和594结合的二抗室温染色1小时，然后进行 VECTASTAIN Elite ABC kit(Vector Laboratories)结合3，3＇-二二氨基联苯胺染色显色，显微镜下观察。

1.5外周血细胞计数(Coulter counter) 50 μg LPS腹腔注射sAPPα-Tg小鼠和严格对照小鼠，分别于注射后12、24、48、72、96、120 小时收获小鼠，心脏采血前首先对小鼠静脉注射500 U肝素。心脏采集的血液使用20倍5 mm EDTA进行稀释，-4°C放置1小时后Coulter Counter(Beckman)进行细胞计数和各种血液指标的分析。

1.6ELISA 分离小鼠大脑组织，其中一半置于500 μl 含有 50 mmol/L Tris-HCl、pH7.6、0.01%NP-40、150 mmol/L NaCl、2 mmol/L EDTA、0.1%SDS、1 mmol/L苯甲基磺酰氟和蛋白抑制混合液(Sigma)进行匀浆。3 000 r/min离心5分钟后收集上清。TNF-α (R＆D Systems) 和 IL-1β (eBioscience)ELISA操作，按照产品说明书进行。

1.7统计学分析 SA(Stereological analysis)按照文献［4］提供方法进行，简单来说，漂浮的大脑切片在进行免疫组织化学染色后，每组随意选择其中的6片进行计数，NeuN阳性细胞使用Nikon Eclipse 600进行计数。小鼠体重变化曲线和大脑内炎症因子数据分析，使用prism4.0统计软件中Nonlinear regression和t-test的方法统计。

2 结果

2.1LPS导致sAPPα-Tg小鼠体重明显降低 为了观察LPS注射对sAPPα过表达小鼠影响，我们采用最简单的体重观察法。对sAPPα-Tg小鼠和相应对照小鼠进行LPS注射，注射后每天称重、记录，直至20天。如图1所示，sAPPα-Tg小鼠体重明显降低，与正常小鼠有着显著性差异。sAPPα-Tg小鼠从出生到3周神经发育完全时，并无任何行为学改变或者病理学改变提示这种小鼠患孤独症，因此，sAPPα过表达的小鼠实际上代表了一种潜在的孤独症发病者，LPS的注射模拟在小儿发育过程中一种感染因素、一种诱因。图中转基因小鼠体重的改变，提示细菌感染，或者是天然免疫系统反应或许是一种诱发具有孤独症发病潜质的儿童发病的始动因素。

图1 LPS注射显著降低sAPPα转基因小鼠体重Fig．1 sAPPα over-expression decrease body weight after LPS injection

2.2LPS导致sAPPα-Tg小鼠大脑广泛损伤 LPS注射小鼠早期体重的改变，提示天然免疫对sAPPα过表达小鼠有着很明显的影响。因为孤独症的早期症状学诊断在实验小鼠模型上非常难于实施，因此我们在注射LPS 14周后收集大脑样本，进行免疫学组织化学染色。图2结果表明，sAPPα-Tg小鼠大脑海马区内有很多无染色区，SA(Stereological analysis)表明sAPPα-Tg小鼠大脑缺损区神经细胞计数与正常小鼠比较有统计学意义(P＜0.05)。初期判断为其他类型神经细胞的置换，考虑正是这种神经细胞的置换，将可能导致小鼠行为学的改变。为了鉴别该缺损区细胞的类型，我们使用了各种神经细胞的抗体进行染色，但结果显示并不符合任何一种神经细胞的表型(数据未示)。根据缺损区的特点，以及周围的血管分布，我们猜测这种无染色的缺损区有可能是一种出血、组织坏死后的纤维增生。

2.3LPS注射引起sAPPα-Tg小鼠大脑内出血的间接证据——血液学指标的改变 我们推测转基因小鼠大脑内的缺损区，是因为组织出血造成的，是因为sAPPα除表达于大脑组织外，还高表达于血小板上［5］。sAPPα在血小板上的表达，可以妨碍血小板的聚集形成止血栓。为了验证我们的推断，采集LPS注射后不同时间点血液，对外周血的细胞计数和各项指标进行检测、分析。检测结果如图3所示，sAPPα-Tg小鼠在LPS注射后早期，HCT和红细胞减少较明显，而对照组中则无明显变化，HCT和红细胞计数表明LPS可导致早期失血状态。与普通失血状态有差异的是，sAPPα-Tg小鼠的血小板改变不明显，与对照组比较，并无统计学意义。也就是说，sAPPα在血小板上的过表达，促使血小板不能很好聚集形成止血栓，因为血小板在出血状态的损失主要是形成止血栓，因此短期内血液中含量改变不大。因为注射的LPS剂量较低，所造成的出血可以很快止住，所以表现为血细胞计数、HCT很快恢复，而血小板含量变化不大。

图2 sAPPα转基因小鼠神经细胞的损伤和丢失Fig．2 sAPPα-Tg mice have neuronal injury and loss

2.4LPS导致sAPPα-Tg小鼠大脑海马区广泛损伤后组织增生 为了鉴别缺损区是否为组织出血后的增生，我们使用了Nissl染色的方法 ，对缺损区和正常区域的细胞进行了比较。结果显示，不管是正常区域，还是缺损区域都是活细胞，但细胞形态差异很大。Nissl染色似乎建议该区域神经细胞的发育畸形，但免疫神经细胞化学结果(图2)，又排除了该区域为神经细胞的可能，因细胞形态细长，推测可能为纤维细胞增生修复。

2.5脑内sAPPα过表达对LPS激发大脑内炎症因子释放无影响 sAPPα-Tg小鼠大脑内的出血可能与过激的天然免疫有关，为了证明小鼠大脑内sAPPα过表达是否改变大脑内的炎症反应，我们进行了以下实验：小剂量LPS注射sAPPα-Tg小鼠和对照组后3天，分离小鼠大脑组织，匀浆并提取上清用于TNF-α、IL-1β、IL-6等前炎因子的ELISA检测，检测结果表明，转基因小鼠和对照组在前炎因子的释放上无明显差异(数据未示)，排除脑内过表达sAPPα可引起炎性反应的改变这一推测。

图3 sAPPα过表达显著降低外周血HCT值和红细胞计数Fig．3 sAPPα over-expression decrease HCT and RBC

图4 Neuronal dysmorphology was revealed by Nissl stainingFig．4 Nissl染色揭示神经细胞形态改变

3 讨论

小儿孤独症(Autism)是一种近年来发病呈上升趋势的疾病，其发病对家庭是一种灾难，因为无特异有效的治疗方法，以及现有方法治疗结果的不确定性，使得该病越来越得到家长和社会的关注。对小儿孤独症发病机制的深入研究，将为该病治疗提供理论基础。

小儿孤独症的发病机制非常复杂：一、大量资料提示本病与遗传有关：某些遗传疾病，如苯丙酮尿症脆性X染色体综合征均常伴有孤独症症状;有些报告指出本症患儿的同胞中有2% ～6%患本症，较一般人口高50倍［6］;还有研究表明小儿孤独症患者体内sAPP-α过表达，与调控该多肽表达基因变异有关;二、有些研究发现孤独症与脑器质性损害有关：如果这些损害发生于产前或围生期，则本症症状出生后即出现;更有研究者认为疫苗免疫所引发的免疫损伤是造小儿孤独症的元凶，此观点曾一度使儿童父母拒绝使用疫苗免疫［7］。但面对着众多严重的感染性疾病，不注射疫苗并非明智之举。那么，疫苗免疫反应、或者儿童时期的感染是导致孤独症发病的元凶，还是对小儿孤独症发生、发展起促进作用，还是根本与本病发展不相关，这些问题需要研究者做更深入研究。

sAPP-α转基因小鼠体内过表达 sAPP-α，模拟一种基因突变可能导致的小儿孤独症。对该小鼠的行为学、症状学分析表明，该小鼠模型在正常状态下并不会自动发展为孤独症小鼠。sAPPα除了表达于大脑组织内，还表达于血小板上，过表达sAPPα的血小板不易聚集成凝血栓［5］。本实验使用这种过表达sAPPα的小鼠作为一种潜在的孤独症小鼠模型，使用低剂量的LPS注射，观察小鼠的体重改变，以及大脑内的病理改变。

sAPPα-Tg小鼠体重在LPS注射初期体重明显降低，说明过表达sAPPα对小鼠的生存状态有影响，那么这种生存状态的改变是否与孤独症的发生有关?分离感染LPS小鼠大脑组织，切片进行免疫组织化学染色，结果如图2所示，过表达sAPPα的小鼠出现了大脑海马区组织病变，病变区各种检测以及外周血各项指标提示为血管出血后的组织修复。sAPPα过表达于血小板上，LPS通过TLR4激发的天然免疫可以造成组织损伤，研究也发现TLR4对大脑出血影响很大［8，9］。在本研究中，正常小鼠内所激发的天然免疫对小鼠没有影响，但在sAPPα-Tg小鼠体内，sAPPα的过表达使得血小板很难形成凝血栓，从而导致大脑组织的出血区域。这种在大脑组织内出血损伤是否是导致孤独症发病的始动因素，还需要进一步实验来验证。那么大脑内过表达的sAPPα在LPS所激发的天然免疫反应似乎影响不大，各种炎性分子释放量并无明显改变。

由感染所引起的机体天然免疫反应，在一定程度上对机体发挥着保护作用，是清除微生物感染的第一道防线，但是对于具有孤独症发病机制的小鼠，感染或者疫苗所激发的机体天然免疫反应，却似乎扮演着双刃剑的角色，在发挥对机体保护作用的前提下，对大脑组织的损害也是显而易见的。对新生儿体检过程中，凡是过表达sAPPα的儿童，应该进行有效的预防感染的措施，必要时进行一些免疫抑制的治疗，或许能减少感染对大脑组织所造成的损伤，对预防该类儿童发展成为孤独症也许是一种有效措施。

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5 Smirnov A，Trupp A，Henkel A W et al．Differential processing and secretion of Abeta peptides and sAPPalpha in human platelets is regulated by thrombin and prostaglandine 2［J］.Neurobiol Aging，2009;30(10)：1552-1562.

6 Ritvo E R，Freeman B J，Mason-Brothers A et al．Concordance for the syndrome of autism in 40 pairs of afflicted twins［J］.Am J Psychiatry，1985;142(1)：74-77.

7 Flaherty D K.The vaccine-autism connection：a public health crisis caused by unethical medical practices and fraudulent science［J］.Ann Pharmacother，2011;45(10)：1302-1304.

8 Smithason S，Moore S K，Provencio J J.Systemic administration of LPS worsens delayed deterioration associated with vasospasm after subarachnoid hemorrhage through a Myeloid cell-dependent mechanism ［J］.Neurocrit Care，2012;16(2)：327-334.

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