Cpn0308真核表达载体的构建及对小鼠免疫功能的影响

贾晓晖 贾天军 李 萍 (河北北方学院医学检验学院，张家口07500)

肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae，Cpn)是一个广泛流行的呼吸系统病原体，为严格细胞内寄生菌，可导致多种疾病，最常见的是衣原体性肺炎、支气管炎和哮喘［1］。肺炎衣原体与慢性肺部疾病相关，也可能与形成主动脉/冠状动脉粥样硬化、脑血管疾病、肺癌以及结节性红斑等疾病有关，日益受到人们的关注［2-5］。Cpn分离培养较困难，从而影响深入研究其致病机制、特异性诊断和疫苗的开发。

包涵体是衣原体赖以生存和繁殖的微环境，包涵体膜蛋白(Inclusion membrane proteins，Inc)是衣原体基因编码、表达定位于包涵体膜上的蛋白质，仅在感染期间表达的、专门定位于包涵体膜上的衣原体特有的蛋白质，已有的研究初步显示包涵体膜蛋白在包涵体内衣原体复制、营养摄取及信号转换等方面发挥重要作用，并且在感染人群中表现出一定的免疫原性，这对进一步探讨包涵体膜蛋白的生物学、了解衣原体致病机制以及衣原体感染的预防提供新的途径［6-8］。CpnAR39全基因组长1 222 853 nt，包含1 167个基因。本研究选择 CpnAR39株Cpn0308基因作为研究对象，是新发现的包涵体膜蛋白，该基因在染色体上的占据位置为第349 243 bp到349 599 bp，基因长度为366 bp。我们实验室已有的实验结果证明Cpn0308定位于包涵体上［9，10］，且具有较强的免疫原性(本实验室资料，未发表)。本实验构建重组质粒pcDNA3.1/His ACpn0308，将重组质粒腹腔注射小鼠一定时间后观察小鼠免疫反应变化，期望增强小鼠对肺炎衣原体免疫防御能力，为进一步研究Cpn0308免疫保护性奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株和载体质粒 CpnAR39标准株纯化基因组DNA模板为美国德克萨斯大学圣安东尼奥医学中心微生物学系钟光明教授惠赠;HeLa细胞、工程菌E．coli XL1-Blue、真核表达载体pcDNA3.1/His A为本研究所保存。

1.1.2主要试剂 Taq DNA聚合酶、T4连接酶、限制性内切酶 BamHⅠ(50 U/μl)、NotⅠ(10 U/μl)、EcoR V(15 U/μl)、dNTP(2.5 mol/L)、IPTG 购于大连TaKaRa公司;DNA Marker购于南京金思瑞生物科技有限公司;低分子量预染蛋白质分子量Marker购于南京凯基生物;PVDF膜购于Millipore公司。

1.1.3抗体 Cpn0308多克隆抗体为本实验室制备并保存;辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体购于南京金思瑞生物科技有限公司;异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG抗体购于Solarbio公司;小鼠IL-4、IFN-γ ELISA检测试剂盒购于江苏希望生物制品有限公司。

1.1.4实验用小鼠 雌性BALB/c小鼠30只，4～5周，购于中国医学科学院动物中心，编号：0170779。

1.2实验方法

1.2.1真核表达重组载体构建与鉴定 根据GeneBank提供的CpnAR39株Cpn0308基因序列(AE001363)，应用Primer 5软件设计一对引物，P1：5＇-CGCGGATCCATGGCTACAGTAGCACAAACA-3＇，划线部分为 BamH Ⅰ酶切位点;P2：5＇-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTTATTTAGAGGAGTAACGAT-3＇，划线部分为NotⅠ酶切位点。经过PCR扩增得到目的基因，然后分别对PCR扩增产物和pcDNA3.1/His A质粒行BamHⅠ和NotⅠ双酶切，纯化酶切产物，混合 BamHⅠ/NotⅠ处理后的 PCR产物和pcDNA3.1/His A酶切产物，加入连接酶，16℃过夜。次日将连接产物转化入感受态E．coli XL1-blue，接种到LB固体选择性培养基(含Ampicillin，100 μg/ml)37℃过夜，做菌落PCR初步筛选阳性克隆。从阳性克隆培养物中提取重组质粒，行PCR、EcoR V单酶切(Cpn0308基因中含有EcoR V限制性内切酶酶切位点)和双酶切，验证重组质粒准确性;取部分质粒送由公司进行序列测定。测序结果验证正确后得到阳性真核表达重组体pcDNA3.1/His ACpn0308，试剂盒大量提取质粒备用。

1.2.2pcDNA3.1/His A-Cpn0308在真核细胞内表达 严格按照脂质体转染说明书将重组质粒转染HeLa细胞，同时以转染空质粒pcDNA3.1/His A的细胞做阴性对照。将转染后置37℃、5%CO2培养箱中培养24小时后的转染细胞取出，进行间接免疫荧光检测，立即荧光显微镜下观察并记录结果。

1.2.3对小鼠免疫功能影响

1.2.3.1动物免疫 实验用BALB/c小鼠稳定饲养1周，按完全随机方式将小鼠分为pcDNA3.1/His A-Cpn0308重组质粒组，pcDNA3.1/His A质粒组，PBS对照组，共3组，每组10只。将大量提取的pcDNA3.1/His A-Cpn0308重组质粒及pcDNA3.1/His A质粒用无菌PBS稀释为1 μg/ml，采用腹腔注射方法分别免疫各组小鼠，每种质粒用量为100 μg，并与第0、14和28天进行3次免疫，注意无菌操作。末次免疫后2周，处死小鼠取全血，离心分离、保存血清，检测抗体及细胞因子。

1.2.3.2抗体水平检测 应用间接ELISA方法检测血清抗体水平。ELISA板为本实验室自己制备，所包被抗原为原核表达的Cpn0308蛋白(包被浓度10 μg/ml)，经预实验证实与无关血清无交叉反应且敏感性较高。用于检测不同组别小鼠体内Cpn0308蛋白IgG抗体水平。

1.2.3.3Western blot检测抗体特异性 应用Western blot方法检测小鼠血清中Cpn0308蛋白抗体特异性，具体方法参照文献［11］。

1.2.3.4细胞因子水平检测 ELISA试剂盒检测小鼠血清中IFN-γ和IL-4水平，严格按照说明书进行操作，再根据样品的A450值在回归方程上计算出对应的样本浓度，记录数据用统计学软件进行统计学处理与分析。

1.3数据统计和分析 用SPSS17.0软件包，采用Student t test对数据进行统计学分析，实验数据以±s表示，P＜0.05视为具有统计学差异。

2 结果

2.1真核表达重组载体构建与鉴定 pcDNA3.1/His A-Cpn0308重组质粒用引物 P1，P2扩增出约400 bp左右的条带;重组质粒经BamHⅠ和NotⅠ双酶切后，可切出2个片段，大小与预期结果相吻合;经BamHⅠ单酶切后位置较双酶切第二条带靠上;对 pcDNA3.1/His A-Cpn0308 PCR产物进行EcoR V限制性内切后，出现两条带，分子量大小分别为81 bp和312 bp，与预期结果相符，结果显示(见图1)。序列分析证实，测序结果与GeneBank登录的肺炎衣原体AR39株Cpn0308基因碱基序列完全一致，且密码子读码框架正确，基因片段全长366 bp，编码121个氨基酸，该登录序列号为AE001363，对比结果如下，测序图略。

2.2真核细胞内表达检测 在荧光显微镜下，pcDNA3.1/His A-Cpn0308重组质粒转染的细胞，用蓝光激发可见细胞胞浆内有较强的黄绿色荧光，用紫外光激发，可见细胞核呈蓝色;空质粒转染的细胞用蓝光激发细胞内无着色，用紫外光激发可见细胞核呈蓝色，结果显示(见图2)。

图1 重组质粒鉴定结果Fig．1 Identification of recombinant plasmid

2.3小鼠免疫结果

2.3.1血清中Cpn0308抗体水平检测 ELISA检测血清中Cpn0308 IgG抗体水平，pcDNA3.1/His ACpn0308重组质粒免疫组、pcDNA3.1/His A质粒对照组与PBS对照组血清抗体A450结果显示(见表1)。2.3.2抗体特异性检测 WB检测血清中Cpn0308抗体特异性，在39 kD处pcDNA3.1/His A-Cpn0308重组质粒组出现条带，pcDNA3.1/His A质粒对照组与PBS对照组无，结果显示见图3。

2.3.3血清中细胞因子检测 末次免疫2周后取血，ELISA检测血清中IFN-γ和IL-4含量，检测结果如表2。pcDNA3.1/His A-Cpn0308质粒组与pcDNA3.1/His A质粒对照组、PBS对照组之间差异极显著(P＜0.01)，空质粒对照组和PBS对照组之间差异不显著(P＞0.05)，结果显示见表2。

图2 细胞内Cpn0308表达情况检测结果Fig．2 Assay results of Cpn0308 expression in cells

图3 Cpn0308特异性抗体WB检测结果Fig．3 WB analysis of the specificity of antibody to Cpn0308

表1 不同组别小鼠血清IgG抗体检测结果Tab．1 A450values of the serum IgG antibody in different groups

表2 不同组别小鼠血清中细胞因子检测结果Tab．2 A450values of the serum cytokines in different groups

3 讨论

Cpn对人类健康构成极大的威胁，近年来Cpn感染呈上升趋势，且多以隐性、持续性感染形式存在，造成进行性、不可逆性的病理变化，引起各种严重而难于治疗的并发症［12］，然而其确切的致病机制还不清楚。由于包涵体膜蛋白作用的特殊性，使其成为疫苗研制的靶蛋白，包涵体膜蛋白基因成为构建Cpn DNA疫苗的候选基因。Cpn0308基因是预测出的一种编码 Cpn包涵体膜蛋白基因［9，10］，本实验室已经成功构建Cpn0308原核表达载体并在大肠杆菌 E．coli XL1-blue中得到高效表达，经间接ELISA法分析其免疫原性得知Cpn0308蛋白有较强的免疫原性，因此Cpn0308蛋白成为疫苗研制的侯选蛋白，Cpn0308基因就成为构建Cpn DNA疫苗的可能候选基因。

本实验依据基因库提供的基因序列设计引物，从CpnAR39基因组中扩增出Cpn0308基因，核苷酸序列测序证实与GeneBank登录的核苷酸序列一致，选择双酶切方法使目的基因定向插入到pcDNA3.1/His A载体中，构建了表达重组体pcDNA3.1/His ACpn0308。连接成功后通过质粒双酶切、质粒PCR、质粒序列测定等不同的方法对重组体进行确定，证实克隆到载体中目的基因序列的正确性。

将重组质粒导入哺乳动物细胞有多种方法，最常用的方法有：脂质体法介导的基因转移、电穿孔法、磷酸钙共沉淀法等。脂质体是由一种脂质双分子层形成的微囊结构可以将外源DNA包裹在其中，并且一起转入细胞。同时脂质体几乎不具通透性，可以保护包裹在其中的DNA免受核酸酶的降解。本实验就选择阳离子脂质体介导构建重组质粒转染HeLa细胞，并应用间接免疫荧光法，在荧光显微镜下直接观察细胞内目的蛋白表达情况。结果显示重组质粒转染组细胞胞浆内出现黄绿色荧光，而空质粒组和空细胞对照组胞浆无荧光出现，说明构建的pcDNA3.1/His A-Cpn0308真核表达载体在体外真核细胞中得到了表达。

质粒DNA接种的方法对免疫保护性效果有很大影响，本实验选择腹腔注射方式对小鼠进行基因免疫，结果显示实验组小鼠血清中Cpn0308总IgG抗体水平明显升高，与对照组相比具有统计学差异;实验组小鼠血清中IFN-γ和IL-4水平与对照组相比明显升高，具有统计学意义。体液免疫和细胞免疫反应是核酸疫苗诱导机体抵抗病原攻击的主要机制［13］，本实验中IgG抗体和细胞因子的提高表明实验组小鼠与对照组小鼠相比免疫功能增强，说明本实验构建的pcDNA3.1/His A-Cpn0308真核表达载体有可能增强小鼠的免疫功能，可能对肺炎衣原体感染具有抵抗能力，我们的后续实验将从病原体攻击等方面进一步验证这一推断。

尽管已经明确Cpn是人体一种重要的致病菌，但国内外近年来关于Cpn的研究多局限于分析Cpn与多种疾病的相关性，而在肺炎衣原体预防和诊断方面进展并不多。疫苗被认为是预防衣原体感染最好的方法，但是疫苗候选的筛选方法并不完善，至今为止仍没有有效的Cpn蛋白疫苗和DNA疫苗应用于临床。随着DNA疫苗研究的不断深入，将会有更多更有效的肺炎衣原体DNA疫苗的方法被发现，使这种最简单直接的基因疗法能及早应用和服务于人类的健康事业。

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