水蛭、斑蝥对小鼠移植肉瘤S180血管形成的影响＊

吴秋玲，卢宏达，郭继龙，孔庆志△

(1.山西中医学院，太原 030024;2.武汉市中心医院，武汉 430014)

1 材料

1.1 动物

昆明种小鼠70只，体重为20g±2g，6～8周龄，雌雄各半，由山西医科大学实验动物中心提供。实验前分笼饲养2d，实验过程动物自由摄食、摄水。

1.2 瘤株

瘤株为小鼠腹水型肉瘤细胞株S180细胞，由山西医科大学药物所肿瘤室提供，常规复苏传代培养。

1.3 主要药品与试剂器材

1.3.1 药品 水蛭、斑蝥由山西省中医药研究院中药房提供，经山西中医学院中药系专家鉴定质量符合实验要求。水蛭为水蛭科动物柳叶蚂蟥whitmannia acranulata Whitman的干燥体。斑蝥为芫菁科芫菁属昆虫南方大斑蝥Mylabris phalerata Pall的干燥虫体。

1.3.2 试剂 RPMI1640培养基(含2.05mmol L-谷氨酰胺)，购自HyClone公司;胎牛血清，杭州四季青生物工程研究所;二甲基亚砜DMSO，购自北京索莱宝科技有限公司;VEGF免疫组化检测试剂盒，购自武汉博士德生物公司;鼠抗人CD34单克隆抗体，为即用型，S-P超敏试剂盒为武汉博士德生物公司产品;基质金属蛋白酶MMP-9兔抗多克隆抗体(BA0573)，武汉博士德生物工程有限公司;Powervision免疫组化检测试剂(PV-6001/6002)，北京中山生物技术有限公司;浓缩型DAB试剂盒(ZLI-9017/9018)，武汉博士德生物工程有限公司;即用型SABC免疫组化染色试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司。

1.3.3 器材 超净工作台BBS-DSC，上海巴艾贝斯;AnKe 80-2C台式离心机，北京医用离心机厂;Heal force二氧化碳培养箱HF90型;电热恒温孵育箱，DHP-9162上海一恒科技有限公司;倒置荧光显微镜图像采集处理系统DP70IPP5.11，日本奥林巴斯。

2 方法

2.1 水蛭、斑蝥浓缩液的制备

将水蛭、斑蝥(去头、足、翅)加水浸泡30min，按常规制备各水煎液，再浓缩成相当于含水蛭生药1g/ml的浓缩液和相当于含斑蝥生药3mg/ml的浓缩液。4℃冰箱保存备用，用前摇匀。

2.2 荷瘤小鼠模型的建立

2.2.1 肿瘤细胞悬液的制备 体外复苏培养S180细胞，将S180细胞培养于RPMI1640培养基，含青霉素1×105u/L和链霉素100mg/L中，置于37℃5%CO2的培养箱中培养。在细胞的指数生长期收集细胞，1000转速离心，PBS洗涤离心去上清，无菌生理盐水稀释，调整到2～3×106/ml。随机选取10只6～8周龄健康小鼠，每只用上述细胞悬液0.4ml进行腹腔注射，约10d后接种小鼠出现腹部明显凸出、涨大，将小鼠颈椎脱臼处死，超净工作台内无菌抽取乳白色腹水液，用生理盐水稀释，镜检计数肿瘤细胞，调整细胞数为1～2×107/m1备用。

2.2.2 荷瘤小鼠模型的建立 60只小鼠，每只小鼠于左上肢腋窝消毒后皮下接种0.2ml的肿瘤细胞悬液。

2.2.3 分组与给药 小鼠接种肿瘤后随机分为水蛭高低剂量组、斑蝥高低剂量组、生理盐水对照组5组，各组小鼠分别称重。

计算小鼠给药剂量，各组小鼠给药按照临床等效剂量，根据人和鼠给药剂量换算公式[1]计算:dB=dA×RB/RA×(WA/WB)1/3换算，公式中dB为动物剂量(mg/kg)，dA为人的剂量(mg/kg)，RB动物体型系数，小鼠为59;RA人体型系数为100;WB动物体重(kg)，WA人体重(kg)。成人体重按60kg每天口服水蛭9g或斑蝥0.045g，按照以上所述算得小鼠每天给药剂量。水蛭高剂量组为0.4ml/10g/d)，水蛭低剂量组为0.2ml/10g/d，斑蝥高剂量组为2.5ml/10g/d)，斑蝥低剂量组为1.25ml/10g/d，阴性对照组每只0.4ml生理盐水/d。分别给小鼠灌胃每天2次，连续给药10d。

2.2.4 取材、石蜡切片、HE染色 用药后第10天脱颈处死小鼠，剥离肿瘤组织，取材、石蜡切片、HE染色，显微镜下观察。

2.3 观察指标及观察方法

2.3.1 瘤重及抑瘤率 肿瘤抑瘤率=(对照组平均瘤重－用药组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%。

2.3.2 瘤组织形态学观察

2.3.3 肿瘤组织内微血管密度MVD的测定MVD的测定(CD34阳性判断标准)按参考文献方法[2]，凡是染成棕黄色单个内皮细胞或内皮细胞簇均作为1个血管计数，凡管腔带有较厚肌层包绕或管腔＞8个红细胞的血管区域不予计数。计数方法:先用100倍视野内选取3个血管高密度的区域，再转到200倍视野计数每个区域的血管数量，取3个数值的平均值作为微血管密度(MVD)。

2.3.4 肿瘤组织内VEGF免疫组化测定VEGF免疫组化测试根据试剂说明书进行，切片、免疫组化染色方法同上。判断结果如下:阳性细胞呈棕黄色，免疫组化染色评分标准按Rahman等报道[3]的方法进行。VEGF的评分标准是:根据着色细胞的比例，即染色范围及染色强度，染色范围根据阳性细胞比率分为0至4级:阴性0分;阳性细胞率在1%～25%为1分;阳性细胞率在26%～50%为2分;阳性细胞率在51%～75%为3分;阳性细胞率在76%～100%为4分。根据染色强度分为0至3级:阴性为0分;弱阳性1分;中等强度2分;强阳性3分，两者得分相加之和为最后评分。

2.3.5 基质金属蛋白酶(MMP-9)检测 检测采用ABC法。切片置载物台上，采用物镜40×，以Image-Pro Plus图像分析软件，参照文献报道计分法给予评分[4]:随机选取5个高倍镜视野，根据细胞膜或浆的染色程度及染色细胞的百分比分析评分:基本不着色为0分，着色淡为1分，着色适中为2分，着色较深为3分;着色细胞占计数细胞的百分率≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，≥51%为3分。分别将每张切片着色度得分和着色细胞百分比得分各自相乘是最后得分。总分得0～1分评为阴性(－)，2～3分评为弱阳性(+)，4～5分评为中阳性(++)，≥6分评为强阳性(+++)。

2.4 统计方法

应用SPPS18.0软件进行统计，各组实验数据计量资料均以均数±标准差表示，采用方差分析进行显著性检验;等级资料比较用Kruskal-wallis秩和检验;计数资料采用卡方检验，P＜0.01为差异具有显著性。

3 结果

3.1 抑瘤率

表1显示，在剥离瘤组织时发现，对照组的瘤体明显增大，界限不清，不易剥离，血管分布丰富;而用药组瘤体相对较小，瘤组织色发白，血管分布相对少。实验结果显示，与对照组比较水蛭高低剂量和斑蝥高低剂量组均有明显的抑瘤作用，瘤重明显减轻(P=0.0118，0.0013，0.0001，0.0002);水蛭高低剂量和斑蝥高低剂量组的抑瘤率与对照组相比，均P＜0.01。

3.2 肿瘤组织形态学观察

与对照组比较，各用药组小鼠肿瘤体积较小，形状较规则。经HE染色后切片观察，对照组肿瘤组织成片状、巢状生长，肿瘤细胞排列较密集，肿瘤细胞异型性较多，瘤组织内小血管较丰富。水蛭、斑蝥组均可见不同程度的片状坏死区，瘤细胞密度减小，结缔组织增多，瘤组织及其周围新生微血管数目减少，其中以斑蝥高剂量组为最明显。斑蝥高剂量组部分肿瘤组织中可见有凋亡细胞。

表1 水蛭、斑蝥对S180肉瘤重量及抑瘤率的影响

表1 水蛭、斑蝥对S180肉瘤重量及抑瘤率的影响

注:与对照组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;瘤重t=2.606，3.396，4.160，4.056;抑瘤率t=－12.070，－15.285，－18.769，－18.740。用药组等剂量比较:▲▲P＜0.01;抑瘤率t=－6.286，－3.455

组别 例数 瘤重(g) 抑瘤率(%)对 照 组12 1.319±0.351 0斑蝥高剂量组 11 0.984±0.301* 26.11±4.07＊＊斑 蝥 低 剂 量 组 12 0.892±0.294＊＊ 32.34±6.02＊＊水蛭高剂量组 12 0.796±0.245＊＊ 39.71±5.49＊＊▲▲水 蛭 低 剂 量 组 12 0.809±0.337＊＊ 39.65±7.10＊＊▲▲

3.3 水蛭、斑蝥对S180瘤体MVD的影响

表2显示，经免疫组化SABC法染色后的切片，镜下观察血管内皮细胞被褐染，对照组可见微血管广泛分布于组织间质内，水蛭、斑蝥组微血管相对少见。斑蝥高低剂量组、水蛭高剂量组微血管数目减少较明显(P=0.0252，P=0.0024和P=0.0483)，水蛭低剂量组微血管数目和空白对照组相比有减少，但不具有统计学意义(P=0.1476)。

表2 水蛭、斑蝥对S180肉瘤MVD的影响

表2 水蛭、斑蝥对S180肉瘤MVD的影响

注:与对照组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;t=2.303，3.180，2.104

组别 例数 血管数目对 照 组12 32.16±11.01斑蝥 高 剂 量 组 11 24.54±4.77*斑蝥 低 剂 量 组 12 23.22±7.36＊＊水蛭 高 剂 量 组 12 25.93±8.69*水 蛭 低 剂 量 组12 28.03±7.35

3.4 水蛭、斑蝥对S180瘤体VEGF表达的影响

表3显示，VEGF蛋白在S180肉瘤组织中呈高表达。斑蝥高低剂量组和水蛭高剂量组对VEGF的表达有较明显抑制作用(P=0.0145，0.0420，0.0023)。

表3 水蛭、斑蝥对S180瘤体VEGF表达的影响

表3 水蛭、斑蝥对S180瘤体VEGF表达的影响

注:与对照组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01，t=2.5259，2.4062，3.1976;水蛭高低剂量组比较:▲P＜0.05，t=－2.4597

组别 例数 VEGF 表达评分对 照 组12 5.03±0.89斑 蝥 高 剂 量 组 11 4.19±0.75*斑 蝥 低 剂 量 组 12 4.31±0.46*水 蛭 高 剂 量 组 12 3.99±0.58＊＊水 蛭 低 剂 量 组 12 4.79±1.02▲

3.5 水蛭、斑蝥对S180瘤体基质MMP表达影响(表4)

4 讨论

中医学认为，“癥瘕”、“积聚”的形成与血脉瘀滞、瘀血内结有着密切关系。《灵枢·百病始生》曰:“卒然多食饮则肠满，起居不节，劳力过度则络脉伤。肠胃之络伤，则血溢于肠外，肠外有寒，汁沫与血相搏，则并合凝聚不得散，而积成矣。”说明积证的病机关键为血瘀。王清任《医林改错》曰:“肚腹结块，必有形之血。”元·滑寿在《难经本义》谓:“积蓄也，言血脉不行，蓄积而成病也。”《明医指掌》指出:“若人之气，循环周流，脉络清顺流通，焉有瘤之患也”，阐述了同样的病机特点。关于积聚的治疗，《素问·至真要大论》认为:“坚者削之”，“结者散之”。乳岩、石疽、石瘕、肾岩、石瘿等，均为有形之肿块，坚硬而实，治疗常在理气活血、清热解毒、扶正培本、化痰祛湿等基础上，兼以软坚散结以图其标，消除肿块。而且肿瘤为痼恶之疾，邪毒蕴结于体内，毒陷邪深，非攻不克，故常用有毒之品，借其性峻力猛以攻伐，即肿瘤防治中常用的“以毒攻毒法”。水蛭、斑蝥可破血逐瘀、软坚散结，其药力竣猛，为治疗肿瘤的常用药。

表4 水蛭、斑蝥对S180肉瘤MMP-9的影响

表4 水蛭、斑蝥对S180肉瘤MMP-9的影响

注:P值与对照组比较，秩和统计量为Z=3.3518，3.2510，2.3192，2.7165

组 别例数视野数 阴性数 阳性数(－)(+)(++)(+++)P 值对 照 组10 50 4 18 15 13斑蝥高剂量10 50 9 28 11 2 P=0.0011斑蝥低剂量10 50 12 25 8 5 P=0.0016水蛭高剂量10 50 10 24 7 9 P=0.0224水蛭低剂量10 50 12 24 5 9 P =0.0078

水蛭味咸、苦，性平，有小毒，归肝经、膀胱经。《本经》:“治恶血、瘀血、月闭，破血癥积聚。”医圣张仲景用其祛邪扶正，治疗“瘀血”、“水结”之症，显示其独特疗效。张锡纯赞水蛭“存瘀血而不伤新血，纯系水之精华生成，于气分丝毫无损，而血瘀默然于无形，真良药也。”水蛭为噬血之物，擅长搜剔瘀血，功能化瘀血而不伤新血，亦不伤气分，为治瘀血而不伤正气之药，优于一般的活血化瘀药。正如张锡纯所言，水蛭“迟缓则生血不伤，善入则坚积易破，借其力以消既久之滞，自有利而无害也”。临床治疗肿瘤，凡因属瘀血阻滞者，无论久病入络之瘀血或新病骤成之瘀血;也不论血热煎熬之瘀血，还是寒邪凝结所致之瘀血;不论患者体质强弱，均可用水蛭配伍不同的药物治疗。水蛭广泛用于治疗各种肿瘤及疑难杂症。

人类用斑蝥治疗疾病已有2000多年的历史，《仁斋直指方论》中明确记载斑蝥可治疗癌症。《本草纲目》记载:“治疝瘕，解疔毒，沙虱毒，猘犬毒，蛊毒，轻粉毒。”《本经》中称其味辛，有大毒，归肝、胃、肾、大肠和小肠经，具有攻毒蚀疮、逐瘀散结的功效。《别录》曰其“主疥癣，血积。”实验及临床研究均已证实，斑蝥具有明确的抗癌作用，临床用于治疗多种恶性肿瘤，其优势在于不降低周围血中白细胞的数量，且对机体没有明显的免疫抑制作用。

肿瘤血管生成与肿瘤的生长、浸润、转移及预后有着密切关系[5]。肿瘤生长经历了两个明显不同的阶段[6]，即血管前期(即无血管期)和血管生长期。在血管前期肿瘤生长较缓慢，而进入血管生长期，肿瘤内生成大量血管，肿瘤的生长也迅速加快，进入快速增殖阶段。肿瘤血管是肿瘤生长和转移的形态学基础，除了给肿瘤提供营养之外，还不断向人体输送肿瘤细胞，导致恶性肿瘤的转移。

血管新生在体内受到一系列因子调节，其中以血管内皮生长因子(VEGF)最为重要，它是维持血管功能和肿瘤扩增的关键因子。VEGF是目前发现的重要的肿瘤血管生长因子之一，其功能一方面可以诱导内皮细胞增殖、迁移甚至改变其基因表达;另一方面它能增加微血管的通透性，使血浆蛋白渗出于血管外，改变局部的细胞外基质以适应血管生成。肿瘤组织中VEGF的表达水平及血清中VEGF的含量与肿瘤MVD、恶性程度和转移情况呈高度正相关，而与患者的预后则呈显著负相关[7]。微血管密度(MVD)是一种反映肿瘤血管形成程度的量化指标，能较为准确地反映肿瘤内的血管状态，是反映肿瘤诱导血管生成能力的指标，是一个反映恶性肿瘤生物学行为的重要参数。

实验结果显示，水蛭、斑蝥高低剂量组MMP-9呈低表达，结合VEGF的表达也降低MVD减少的结果，说明新血管生成是肿瘤细胞、基质、细胞因子等共同参与、共同作用的结果，同时也提示MMP、VEGF在肿瘤的血管生成及转移过程中具有相互协同的作用。斑蝥、水蛭抑制肿瘤的途径之一可能是通过抑制新生血管的生成来实现的，而VEGF、MVD和MMP-9之间有着密切的联系。

[1]孙敬方.动物实验方法学[M].北京:人民卫生出版社，2001:357.

[2]何振辉，梁念慈.肿瘤血管生成机制与抗肿瘤血管生成[J].国外医学·临床生物化学与检验学分册，2004，25(1):20-23.

[3]Rahman A，Dhar DK，Yamagnchi E，et al.Coexpression of Inducible nitricoxide synthase and cox-2 in hepatocellular Careinoma and surrounding liver，possible involvement of cox-2 in the angiogenesis of hepatitis C virus positive case[J].Clin Can Res.2001，7(5):1325.

[4]陈雷，林建华，张声.MMP-9在骨肉瘤中的表达及其临床意义[J].中国肿瘤临床，2001，28(6):431-433.

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