生地黄免煎颗粒对大鼠脑缺血后Nogo-A蛋白表达的干预*

宋红普魏江磊吴中华韩振祥吴中平朱晖李欢欢

（1.上海中医药大学基础医学院，上海201203；2.上海中医药大学附属曙光医院，上海201203；3.上海市曹杨街道社区卫生服务中心，上海200310）

成人脑缺血造成的中枢神经损伤后不能再生，是导致脑缺血遗留有各种后遗症难以完全康复的重要原因。中枢神经损伤后不能再生，除了与胶质疤痕的空间阻碍作用和神经生长因子的缺乏有关外，主要是由于中枢神经系统中存在着抑制神经细胞生长的抑制因子［1］。本研究在前期发现生地黄及其主要组分梓醇对脑损伤具有保护作用的基础上，进一步观察生地黄免煎颗粒对神经生长抑制因子Nogo-A蛋白表达的干预作用，探讨其对缺血性脑损伤后的应用价值。

1 材料与方法

1.1 动物雄性健康SD大鼠120只分批购入，每批20只，清洁级，体质量230～250 g，由上海中医药大学实验动物中心提供，购自上海西普-必凯实验动物有限公司。医学实验动物合格证号：SCXK（沪）2008-0016，大鼠购入后入IVC系统分笼饲养。大鼠适应性饲养1周左右，体质量符合实验要求之后准备手术造模。1.2造模方法 参照文献采用改良的Longa法［2］制备大脑中动脉闭塞（MCAO）模型，术前12 h禁食，自由进水。用10%水合氯醛按照0.35 mL/100 g体质量腹腔注射麻醉。将麻醉后的大鼠仰卧位固定于鼠板上，颈部备皮，局部消毒之后行颈前部正中切口。分离右侧颈部肌肉，依次暴露右侧颈总、颈外和颈内动脉，结扎颈总和颈外动脉，颈内动脉挂线，用止血钳夹住两端线头交叉放置于手术台上，拉紧颈内动脉挂线之后，用手术纤维剪于颈总动脉分叉下方1cm处剪一切口，将预先购得的头端包被多聚赖氨酸的尼龙栓线向分叉端插入颈总动脉。松开拉住颈内动脉栓线的止血钳后，用手拉紧结扎颈总动脉的线头，用眼科镊将栓线插入颈内动脉17～18 mm，直到有轻微阻力感为止。连同插入的尼龙栓线一起扎紧颈内动脉挂线，剪去露在血管外的尼龙栓线，缝合创口及皮肤。再次消毒后每只大鼠腹腔分别注射4 mL生理盐水，将大鼠置于放有清洁垫料的鼠笼中进行观察。假手术组大鼠麻醉，暴露颈内、外动脉分支后，仅结扎右侧颈总、颈外与颈内动脉，不插入尼龙栓线。

1.3 神经功能评分及纳入标准造模大鼠清醒后2 h进行神经功能评分。神经功能评分按照Longa的标准［2］，进行5级评分：0分为无神经损伤症状；1分为不能完全伸展对侧前爪；2分为向瘫痪侧转圈；3分为向对侧倾倒；4分为不能自发行走，意识丧失。分值在1～3分者为造模成功，纳入相应组别，0分和4分者剔除。凡术中出现蛛网膜下腔出血、死亡、或者神经评分不符合标准的均为模型制作失败，不纳入后续实验，另随机补充大鼠造模，保证每组实验动物数量不变。

1.4 分组将造模成功并经神经功能评分筛选后的大鼠按照随机数字表法进行分组，分为用药组和模型组，另设假手术组。3组大鼠入组后又各自按照取材时间窗的不同分为3、7、14 d各3个亚组，记录每组大鼠的编号，并加以跟踪。各组大鼠在造模成功经分组后，放回IVC系统中饲养。

1.5 药物干预将生地免煎颗粒（购自上海中医药大学附属曙光医院，由三九医药集团股份有限公司生产，批号：10090425）溶于适量清洁自来水中，配制成生地黄含量为135 g/L的生地黄免煎颗粒溶液。用药组大鼠分组称体质量后按照1 mL/100 g灌胃，上下午各1次。模型组和假手术组均同时给予相同体积的清洁自来水灌胃。各组大鼠均每3日称体质量1次，并依据各自体质量调整大鼠的灌胃量，灌胃持续至大鼠处死取材之前。

1.6 标本采集各亚组大鼠分别在各自相应时间点取材，取材时先将大鼠称体质量后0.4 mL/100 g腹腔注射10%水合氯醛深麻醉。将大鼠俯卧位放置于冰上，用剪刀从背部剪开项部皮肤及肌肉，剪短颈椎及脊髓，即可见到有血液从颈部断开处流出，待颈部血液流尽后，用剪刀沿顶骨与枕骨交界处纵向剪开一小口，将剪刀尖部从剪开的缝隙中插入，注意不要触及脑组织。向上外侧用力分别撑开两块顶骨，暴露出两侧大脑半球，用镊子小心撕开软脑膜；用眼科剪沿脑干向下剪短脊髓，换眼科镊捏住连在脑干上的脊髓段，将脑干及相连的脊髓拉出；将眼科剪轻插入大脑底部的空隙中，轻轻向上翘起大脑，剪断颅底的三叉神经和视神经，将整个脑干与颅底结构分离，最后剥离嗅脑并取出完整大脑。在放于碎冰上的培养皿中用手术刀片将距额极5 mm处切取2 mm厚的冠状切片，取切片右侧含皮质及缺血半暗带脑组织约50 mg左右，放入预先标记好的冻存管，转移至-80℃的冰箱中储存备用。

1.7 检测方法 （1）通过对造模前大鼠体质量及造模结束后2 h神经功能评分的观察，了解用药前各组大鼠的基线是否一致。（2）采用Western Blot法检测脑组织中Nogo-A的表达量，一抗购自上海优宁维生物科技有限公司，蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，二抗购自Jackson公司，内参抗体购自上海康成生物工程有限公司。Western Blot检测方法 参照有关文献和试剂盒说明进行，依照组织总蛋白提取、蛋白含量测定、电泳、转膜、封闭与抗体孵育步骤进行，最后进行显色反应，并将胶片或显色后的滤膜进行扫描或拍照，各组样本经过Western Blot检测之后输出显色条带。用凝胶图像处理系统分析目标带的分子量和净光密度值，通过计算各样品与GAPDH内参蛋白的比值，得出Nogo-A蛋白的相对表达量，在此基础上分析生地黄对MCAO造模后大鼠Nogo-A蛋白表达的干预效应。

1.8 统计学处理采用IBM SPSS Statistics19软件进行数据统计学分析：基线一致性检验造模前进行，分别通过方差分析和Kruskal-WallisH检验分析不同组别大鼠体质量和神经学评分；通过方差分析检验造模后相同时间点不同组别之间Nogo-A蛋白相对表达量的差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基线一致性检验见表1，表2。造模前各组大鼠体质量差异无统计学意义（P＞0.05）。用药组与模型组各时间点神经学评分差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 造模前各组大鼠体质量比较（g，s）

表1 造模前各组大鼠体质量比较（g，s）

组别n3 d 7 d14 d用药组6238.34±7.234模型组6235.50±17.108 237.00±14.353229.14±16.416 237.00±10.770226.50±5.875假手术组6231.50±20.345232.33±17.212231.67±14.706

表2 各组大鼠造模清醒后神经学评分比较（n）

2.2 Nogo-A蛋白表达情况见表3。在造模后第3日和7 d时间点上，用药组和模型组Nogo-A蛋白的表达与假手术组比较没有统计学差异（P＞0.05），在第14日时间点上，与模型组比较，用药组出现了显著差异（P＜0.05）。

表3 各组大鼠Nogo-A蛋白表达比较（±s）

表3 各组大鼠Nogo-A蛋白表达比较（±s）

与模型组同时段比较，*P＜0.05。

组别n3 d 7 d14 d用药组60.727±0.422模型组61.968±2.087 1.281±0.3081.061±0.467*3.293±2.4062.010±0.581假手术组61.020±0.2601.195±0.8131.625±0.698

2.3 不同时间窗各组Nogo-A蛋白表达量的趋势变化见图1。用药组和模型组Nogo-A蛋白的表达在造模后3～14 d均呈现先上升后下降的趋势，且模型组的波动更加明显一些。造模后第3日用药组Nogo-A的表达水平较模型组为低。到造模后第7日时，用药组和模型组Nogo-A蛋白的表达均有所升高，模型组升高的幅度更大一些。到了第14日，用药组和模型组Nogo-A蛋白的表达均有下降，且用药组明显低于模型组，出现了统计学差异。造模后3～14 d，用药组和假手术组Nogo-A蛋白的表达始终低于模型组，用药组和假手术组相比水平相近或略低。

图1 各组不同时间Nogo-A蛋白表达情况（±s）

3 讨论

缺血性脑卒中属中医学“中风”范畴，该病起病急骤，发病迅速，而且难以彻底治愈，往往会留有各种不同程度的后遗症。成人脑缺血后造成的中枢神经损伤后不能再生，是造成脑缺血后遗留有各种后遗症，难以完全康复的重要原因。研究表明，中枢神经元不能再生，除了与胶质疤痕的空间阻碍作用和神经生长因子的缺乏之外，主要是由于中枢神经系统中存在着抑制神经细胞生长的抑制因子，这些抑制因子主要包括硫酸软骨素蛋白多糖（CSPG）、NG2蛋白多糖、可溶性髓磷脂相关糖蛋白（MAG）、少突细胞髓磷脂糖蛋白（OMgp）和Nogo蛋白。其中，Nogo蛋白作为抑制中枢神经再生最重要的物质，越来越受到人们的重视。Nogo是在中枢神经系统髓磷脂中发现的一种抑制轴突生长的蛋白，因它对轴突生长具有抑制作用而被命名为Nogo，编码Nogo蛋白的基因称为Nogo基因。由于启动子和剪切方式的不同，Nogo基因可以表达出3种mRNA的转录体，它们所编码的蛋白质分别称为Nogo-A、Nogo-B和Nogo-C［3-4］。其中，Nogo-A是Nogo蛋白中最主要的形式，在中枢神经系统中由少突胶质细胞和一些神经元产生，存在于髓鞘的内外环和少突胶质细胞表面，是突触再生抑制物［5］。Nogo是中枢神经系统髓鞘磷脂中最重要的一种抑制轴突生长锥再生的蛋白质，它可导致生长锥塌陷并抑制神经元突起的延伸，也能够被特异性抗体IN-1识别。实验发现，神经元生长过程中对Nogo基因的表达变化特别敏感，针对Nogo-A的抗体可抵消中枢神经系统髓鞘在体外的抑制活性，表明Nogo蛋白具有强烈的中枢神经生长抑制活性。

临床实践表明，中药生地黄制剂对中风急性期脑损伤治疗有可靠疗效［6-7］，机理研究也显示中药生地黄及其主要组分梓醇有促使神经元超极化，保护神经元免受细胞毒性损伤［8-10］，减轻脑缺血后神经元凋亡［11-12］等作用，显示中药生地黄及其组分梓醇对脑损伤具有保护作用。另外，梓醇还可上调脑缺血大鼠缺血周围区皮质生长相关蛋白43（GAP-43）的表达，促进轴突再生，加速神经功能恢复［13］。但在生地黄对神经生长抑制因子表达的干预效应的研究方面，尚不多见。

从本实验的结果 来看，经MCAO造模造成脑缺血损伤之后，Nogo-A蛋白的表达出现升高趋势，且呈现先上升后下降的趋势，在第7日表达最为活跃；MCAO造模后经生地黄免煎颗粒溶液灌胃干预以后，Nogo-A蛋白的表达水平均较模型组降低，且呈现先升高后又缓慢恢复的趋势；相对于模型组，在造模后第14日，生地黄对Nogo-A蛋白的表达有明显的下调作用。

由此可见，生地黄免煎颗粒能够在一定程度上下调MCAO造模后引起的Nogo-A蛋白表达升高，有利于中枢神经缺血后的神经再生。

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