实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠中枢神经组织中ZO-1 mRNA的变化及益肾达络饮对其的影响*

吴彦青 高 颖 朱陵群 娄丽霞 张东梅

（1.天津中医药大学，天津 300193；2.北京中医药大学东直门医院中医内科学教育部重点实验室，北京 100700）

血脑屏障（BBB）是机体参与固有免疫的内部屏障之一，维持中枢神经系统（CNS）正常功能和内环境稳定所必需的一种弥散屏障［1-4］。BBB完整性的破坏已被证明为多发性硬化（MS）和其理想动物模型即实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）发病机制中的重要环节［5-11］，并且在 MS 的发病过程中起着重要的作用［12］。为进一步明确MS血脑屏障功能及结构的动态变化，本研究观察EAE小鼠血脑屏障通透性的动态变化，探讨脑和脊髓内紧密连接构成蛋白（ZO-1）基因在EAE发病过程中几个重要时间点的动态表达变化以及其与血脑屏障功能变化的关系，并为MS在发病过程中血脑屏障完整性破坏提供分子结构上的依据以及下一步可能干预的途径。

1 材料与方法

1.1 动物 C57BL/6小鼠购自中国医学科学院实验动物研究所， 许可证号：SCXK （京）：2005-0013。 选用 8～10周龄雌性C57BL/6小鼠108只，体质量（18.4±0.8）g。实验小鼠饲养在中国中医科学院基础研究所二级动物中心饲养室。

1.2 试剂及药物 MOG35-55多肽（MEVGWYRSPFSRVVHLYNGK）由北京赛百盛生物工程公司合成，纯度（HPLC）98.3%；完全弗氏佐剂（CFA）购自美国 sigma公司，批号：049K8700；百日咳毒素（PTX）购自美国sigma公司，批号：P7208；结核分支杆菌菌（H37RA）购自美国 DIFCO 公司，批号：0172191；POWER SYBR GREEN PCR MASTER试剂购于美国ABI公司，批号：4367659。益肾达络饮（由熟地黄、石菖蒲、栀子、豨莶草等药物组成），饮片购自北京中医药大学东直门医院，常规方法煎煮，收集滤液并文火煎煮浓缩制成2 g生药/mL的水提物。醋酸泼尼松，天津力生制药股份有限公司，批号：081206，用去离子水配制成0.39 mg/mL溶液。

1.3 模型制备 采用MOG35-55抗原免疫C57BL/6小鼠。将等体积的 MOG35-55 水溶液（每 100 μL 含 MOG35-55 200 μg）与完全弗氏免疫佐剂 （每100 μL含结核杆菌H37RA 500 μg）混合乳化制成油包水的抗原乳剂。于免疫动物当日记为第0日，模型组、激素组、中药组每只小鼠背侧脊柱中线两侧分四点皮下注射共计0.2 mL MOG35-55抗原配剂，佐剂组每只小鼠背侧脊柱中线两侧分四点皮下注射共计0.2 mL不含MOG35-55的油包水乳剂；注射完配剂30 min后，佐剂组、模型组、激素组、中药组每只小鼠均腹腔内注射0.1 mL（含400 ng PTX）百日咳毒素溶液，48 h后再次腹腔内注射0.1 mL PTX溶液1次；正常组小鼠不给予任何药物干预。

1.4 分组与给药 实验分4个取材时点，即造模后7 d（发病前期）、14 d（发病初期）、24 d（发病急性期）和 40 d（慢性期）。 实验前将所有C57BL/6小鼠随机分组：正常组（24只）、佐剂组（24只）、模型组（24 只）、激素组（18 只）、中药组（18 只），共 5 组。 免疫后第7日起，每日给予各组小鼠灌服相应的药物。

1.5 神经功能评分 小鼠免疫后，由两名观察者采用盲法进行神经功能评分，观察时间为第0日到第40日（共41 d），评分标准根据Kono等［13］的5级评分法：0分为小鼠不发病；1分为小鼠出现尾部张力降低或轻度步态笨拙；2分为小鼠尾部完全无张力，和（或）中度步态异常，和（或）姿态维持缺乏；3分为小鼠肢体明显力弱；4分为小鼠肢体麻痹或瘫痪；5分为小鼠处于濒死状态。测评分≥1分为发病动物。评价EAE发病严重程度的指标包括：每日平均临床评分、平均起病天数、疾病指数及平均最高 评分［14］。

1.6 实时荧光定量PCR检测CD4mRNA的表达 ZO-1及βactin引物均由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成，引物序列见表1。

表1 引物序列

小鼠在相应时间点处死后，超净工作台上快速取大脑和脊髓组织，每组6只，液氮冷冻。取脑或脊髓组织约100 mg，采用异硫氰酸胍一步法抽提组织总RNA。所提总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳确定其完整性，紫外分光光度计检测含量和纯度。取2.0 μg总RNA进行逆转录反应，采用SYBR Green荧光染料技术进行实时荧光定量PCR扩增。记录其循环阈值（Ct），每个样品中靶基因的相对mRNA表达采用相对定量公式2-△△Ct计算，其中△Ct值＝靶基因Ct值-β-actin Ct值。

1.7 统计学处理 采用SPSS13.0统计学软件分析，组间比较采用单因素方差分析，以（±s）表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 造模后EAE小鼠行为学观察结果 见表2。结果示各治疗组与模型组相比，各治疗组的平均起病天数明显延迟（P＜0.05），平均最高评分明显降低（P＜0.05），疾病指数显著降低（P＜0.05）。

表2 EAE小鼠神经功能评分情况（±s）

表2 EAE小鼠神经功能评分情况（±s）

与模型组比较，*P＜0.05。

平均起病时间（d） 每日平均临床评分（分）12.33±1.23 3.88±0.80激素治疗组疾病指数 平均最高评分（分）模型组 90.54±30.75 3.21±1.25组 别13.33±1.61* 3.54±1.08中药治疗组 14.33±1.97* 3.50±0.81 62.14±25.46* 2.00±0.77*67.29±25.80* 2.13±0.83*

2.2 造模后EAE小鼠脑和脊髓内ZO-1 mRNA的表达 见表3～表4。与正常组比较，免疫后7 d，EAE小鼠脑内ZO-1 mRNA的表达显著降低（P＜0.05），而脊髓内表达未见显著改变（P＞0.05）；至免疫后14 d，EAE小鼠脑内ZO-1 mRNA的表达未见显著改变（P＞0.05），而脊髓内表达显著降低（P＜0.05）；免疫后24 d，EAE小鼠脑和脊髓内ZO-1 mRNA的表达继续显著降低（P＜0.05或0.01）；免疫后40 d，EAE小鼠脑内ZO-1 mRNA的表达未见显著改变（P＞0.05），而脊髓ZO-1 mRNA内表达显著降低（P＜0.05）。

经过益肾达络饮治疗后在14、24、40 d EAE小鼠脑组织ZO-1 mRNA的表达未见显著改变（P＞0.05）。中药治疗组EAE小鼠脊髓组织ZO-1 mRNA的表达在14 d时与模型组一样出现显著降低 （P＜0.05），且与模型组比较未见显著差异 （P＞0.05）。中药治疗组在24 d和40 d EAE小鼠脊髓中ZO-1 mRNA的表达与正常组比较均未见显著改变（P＞0.05）；与模型组比较，在第40日中药治疗组EAE小鼠脊髓中ZO-1 mRNA的表达显著增加（P＜0.05）。

经过激素治疗后在 14、24、40 d EAE小鼠脑组织 ZO-1 mRNA的表达未见显著改变（P＞0.05）。在14 d激素治疗组EAE小鼠脊髓组织中ZO-1 mRNA的表达明显降低（P＞0.05），而在24 d和40 d激素治疗组EAE小鼠脊髓组织中ZO-1 mRNA的表达均未见显著改变（P＞0.05）。

表3 ZO-1 mRNA在大脑组织中的表达（ZO-1/β-actin）

表4 ZO-1 mRNA在脊髓组织中的表达（ZO-1/β-actin）

佐剂组在免疫后7、14、24、40 d EAE小鼠脑和脊髓组织中ZO-1 mRNA的表达未见显著改变（P>0.05）。

3 讨 论

多发性硬化及其动物模型EAE是一类主要由T细胞介导的自身免疫性疾病，T细胞针对髓鞘成分的反应在MS的发病过程中起到了关键的作用。其主要发病机制是某种诱因作用下激活的T细胞透过BBB进入到脑实质结合中枢的抗原递呈细胞抗原，通过再刺激分泌出大量的趋化因子和细胞因子，进一步促使B细胞和巨噬细胞的活化，募集外周血T细胞、单核细胞以及B细胞等进入到炎症部位，从而导致中枢神经轴索的损害以及神经组织的炎症脱髓鞘反应［15-16］。

BBB的基础结构是脑微血管内皮细胞（BMEC），BMEC及BMEC间广泛的紧密连接（TJ）构成了BBB的第一道屏障，有助于维护脑组织微环境的稳定［17］。TJ是细胞间的通透屏障，通过细胞旁路径调控水、离子和大分子物质的跨膜转运［18］。TJ蛋白表达量的改变、位置分布的变化和（或）结构功能的异常均可能破坏TJ的完整性，引起细胞间连接的开放，导致BBB通透性的改变。TJ由跨膜蛋白、胞质附着蛋白（ZO-1等）与细胞骨架蛋白相连而组成［19-20］。其中ZO-1是紧密连接复合体中一个非常重要的结构蛋白，它一端与胞内侧的细胞骨架蛋白相连接，另一端又连接着跨膜蛋白，起到一个重要连接枢纽的作用［21-22］；其下游与细胞内信号传导相关酶类和细胞激动蛋白相连接，其表达水平以及活性的降低均可以影响到细胞间紧密连接结构的稳定和功能的完整性［23］。因此，ZO-1在中枢神经系统组织内水平的变化与血-脑屏障的损伤程度具有相关性，可反映血脑屏障紧密连接的状态，从而作为血脑屏障破坏的标志［24-25］。

本实验观察了EAE小鼠脑和脊髓内ZO-1 mRNA的表达，发现免疫后7 d，脑内ZO-1 mRNA表达出现显著下降，而脊髓内表达下降不明显；免疫后14、24、40 d脊髓内的ZO-1 mRNA表达均显著低于正常值，脊髓内ZO-1 mRNA表达减少的趋势与神经功能的评分的升高趋势相符。中药复方益肾达络饮可以显著改善EAE模型小鼠神经功能评分，与正常组相比，激素组、中药组在免疫后14、24、40 d ZO-1 mRNA的EAE小鼠大脑以及免疫后14、24、40 d ZO-1 mRNA的EAE小鼠脊髓中表达均未见显著改变，其干预EAE的作用机制可能与血脑屏障紧密连接蛋白调节有关。

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