柑橘内生菌的研究进展

胡秀荣黄振东蒲占湑杜丹超鹿连明陈国庆

（浙江省柑橘研究所台州黄岩318020）

柑橘内生菌的研究进展

胡秀荣黄振东蒲占湑杜丹超鹿连明陈国庆

（浙江省柑橘研究所台州黄岩318020）

植物内生菌是指生活于健康植物组织内部不引发植物明显病症的微生物，但在植物衰老或外界刺激条件下，植物自身免疫力下降，也可能出现某些病症；植物内生菌主要包括真菌、细菌和放线菌等[1]。本文主要综述了柑橘内生菌的最新研究进展，包括内生菌的分离方法、种类及生物防治方面的应用进展情况。

1 柑橘内生细菌

1.1 植物内生细菌一般分离方法

由于内生菌广泛存在于植物的根、茎、叶、花、果实等器官的组织中，所以分离时可以采集健康的植株，然后对样品进行一系列的表面消毒，其中包括酒精、次氯酸钠、高锰酸钾、升汞等消毒剂进行表面消毒，最后用无菌水冲洗干净，将消毒好样品进行无菌研磨，加入少量无菌水，吸取汁液涂平板，待长出细菌后，进行转接纯化，最后一次冲洗水涂板检测表面消毒是否彻底。此外消毒剂选择和消毒的时间应根据样品的软硬程度确定[1]，Samish等曾对不用消毒技术进行比较，并形成标准化程序[2]。

1.2 柑橘内生细菌的研究应用

柑橘内生细菌的研究主要集中于柑橘内生细菌分离及对柑橘炭疽病、溃疡病和油菜菌核病等几种病害的拮抗作用研究。如罗永兰，张志元等[3]从温州蜜柑、甜橙、玉环柚三个品种采集支根、主干皮层、一年生枝条、叶片、果实 5种器官作为分离材料进行内生细菌分离，结果分离出75份内生细菌，分别属于气芽孢杆菌属(Aerobacillus sp.)、气单胞菌属(Aeromonasspp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、黄单孢杆菌属(Xanthomonasspp.)、假单胞杆菌属(Pseudomonasspp.)、土壤杆菌属(Agrobacteriumsp.)、乳杆菌属( Lactabacillussp.)，同时发现内生细菌在不同品种和不同器官中出现的频率不同。罗永兰等[4]对柑橘拮抗内生细菌生物学特性和抗菌产物的热稳定性也进行了相关研究。2004年冉国华等[5]研究了柑橘内生拮抗细菌发酵液对油菜菌核病的田间防治效果，发现两株内生细菌对抑制油菜菌核病病斑扩大有一定效果,但效价不是很高,有必要作进一步的基础研究。余建等[6]研究了柑橘内生拮抗细菌在油菜上的定殖及对油菜菌核病防效，发现拮抗内生细菌对菌核病有较好的抑制效果，并可以从根部进入油菜植株内定殖，属于较为理想的生防菌。2005年袁红旭等[7]从不同品种柑橘果实中分离出16株内生细菌，从中筛选出 4株对柑橘炭疽病有较好防治作用的拮抗内生细菌，其中 1株具有显著促进柚苗生长作用，但没有阐明所分离到内生细菌的分类地位。2005年谭小艳等[8]从中国南宁柑橘叶片中分离到对柑橘溃疡病菌有拮抗作用的细菌菌株，鉴定为洋葱伯克霍尔德氏菌（Burkholderia cepacia），同时该菌对其他作物病害的防治也有潜在的应用价值。

2 柑橘内生真菌

2.1 植物内生真菌的分离方法

内生真菌的分离同样要经过严格的表面消毒，去除表面附生菌及环境中的真菌和细菌，保证分离到的菌为内生菌。分离内生真菌的培养基多为常用真菌培养基，如马铃薯葡萄糖培养基、察氏培养基、玉米粉培养基等。内生真菌分离过程用于表面消毒剂主要有乙醇、升汞、次氯酸钠、甲醛等。何佳等[9]报道采用乙醇浸泡，次氯酸钠浸泡，无菌水漂洗更适合内生真菌的分离，因为次氯酸钠具有较好的挥发性，且毒性较小，即使有少量次氯酸钠浸入植物组织中，也会在平板的培养过程中从植物组织中挥发出来，而且灭菌后用于培养的植物材料剪去了两头褐变氧化部分，所以，次氯酸钠不易残留在植物组织内影响内生真菌从植物材料中长出。

2.2 柑橘内生真菌的研究应用

根据文献记录，柑橘内生真菌有33个属，内生真菌的分类鉴定主要通过形态观察，而对不产孢子的内生真菌，运用分子生物学等方法进行鉴定，以发现新的有价值的菌株。国内对柑橘内生真菌的分离也进行了研究，2008年赵昌会等[11]从湖南永州柑橘的枝、叶、果实中分离培养出20株内生真菌，对部分真菌做了分类鉴定，并对内生真菌的拮抗活性进行了初步的研究，发现柑橘内生真菌的代谢产物多数具有抗金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉的活性。2005年罗永兰等[12]从不用地区不同种类上定点多次取样分离内生真菌，分离到柑橘内生真菌5642株，大部分进行了鉴定，分别属于24属，并新发现15属，柑橘内生真菌表现出丰富的多样性。目前柑橘内生真菌的研究主要集中于内生真菌的分离与鉴定，而对于柑橘内生真菌的代谢产物的研究还较少，内生真菌除了解其抗菌活性外，还可研究其对病虫害的防治，对柑橘树生长、果实产量的影响等，以开发其在生产上的应用价值。

3 柑橘内生放线菌

3.1 植物内生放线菌一般分离方法

先在自来水下冲洗掉样品表面的泥土，再用超声波清洗；然后用99%乙醇处理 1min，3%次氯酸钠处理 5min，最后用99%乙醇再处理30 s。灭菌好的材料用无菌刀切成 1cm× 1cm小块，置于分离培养基表面。同时，将最后一次处理植物样品的清洗液涂在ISP 2培养基上，用以检测表面灭菌的效果。分离培养基置于27℃湿润的环境中培养 2～ 6周，待放线菌长出[13]。

3.2 柑橘内生放线菌的研究应用

植物内生放线菌是一类新的生防微生物资源，在植物病虫害的防治中具有很大的应用潜力。内生放线菌作为内生菌的重要类群，是较新的研究领域，从中有可能发现新型活性化合物或提供模板化合物。从目前所研究的植物中分离到的内生放线菌大多为链霉菌菌属（Streptomyces），少部分为稀有放线菌。在植物内生放线菌的应用方面也有很多报道，主要是在农业上病虫害的防治及在医药上抗肿瘤作用的研究等。

相对于柑橘内生细菌和内生真菌，柑橘内生放线菌研究相对较少，有待研究者进行深入研究。

4 展望

植物内生菌是相对未开发的领域，可能拥有丰富的生物多样性，全世界共有植物接近300000种，而目前所报道的用于内生菌研究的不过几百种，内生放线菌就更少。由于内生菌在植物体内有稳定的生存空间，且能产生与宿主植物代谢相同或相似的生理活性物质，因而能有效地抑制病原菌的侵染或提高宿主植物的抗病性。内生菌分布于宿主植物组织内部，比暴露于外部环境的附生菌和腐生菌具有更稳定的生存环境，更易于发挥作用，加之，植物内生菌具有一定的宿主专一性，除从其宿主植物吸取养料和对侵染宿主植物的其它生物起作用外，对宿主植物本身及其它生物几乎没有影响，而且内生菌可以通过人工接种被导入不同的植物并可以通过植物种子进行遗传，因此植物内生菌具有作为生物农药开发的优良特性。目前柑橘内生菌的研究主要集中在内生真菌和内生细菌的研究，而内生放线菌还很少有人研究，由于从内生放线菌中筛选抗生素具有重大意义，因此柑橘内生放线菌应加强相关研究，以筛选具有潜在价值的菌株应用于农业生产。

[ 1]郝晓娟.植物内生菌[M].北京:中国农业科学技术出版社,2010

[ 2]Samish Z，Etinger-TulezynskaR，Bick M.The microflora within the tissue of fruits and vegetables[J].food Sci,1963,28( 3):259～266

[ 3]罗永兰，张志元，喻珺.柑橘内生细菌的分离与鉴定[J].湖北农业科学,2006,45( 6):773～775

[ 4]罗永兰,张志元,余建等.柑橘拮抗内生细菌重橘 1号的生物学性状及其抗菌产物的热稳定性[J].江西农业学报.2007,19(11):24-26

[ 5]冉国华,张志元.柑橘内生拮抗细菌的发酵液对油菜菌核病的田间防治效果[J].长沙大学学报,2004,18( 4):26～28

[ 6]俞建.柑橘内生细菌YS-45在油菜上的定殖及对菌核病的防效[M].2008

[ 7]袁红旭,陈勇明等.拮抗炭疽病的柑橘内生细菌的分离与筛选[J].果树学报,2005,22( 5): 510～513

[ 8]谭小艳,黄思良等.柑橘溃疡病内生拮抗细菌Bc51的研究[J].植物病理学报,2007,37( 1): 9～17

[ 9]何佳，刘笑洁，赵启美等.植物内生真菌分离方法的研究[J],食品科学,2009,30(15):139～141

[10]李培，王永斌.植物内生真菌的研究与展望[J].饮料工业,2008,11( 7):11～13

[11]赵昌会，黄芳，丁芳.柑橘内生真菌的分离及抗菌活性的初步研究[J].2005,31( 4):418～421

[12]罗永兰,张志元,冉国华.柑橘内生真菌的分离与鉴定[J].湖南农业大学学报（自然科学版）.2005,31( 4):418～421

[13]阮继生，黄英.放线菌快速鉴定与系统分类[M].北京:科学出版社,2011