γ干扰素释放试验在检测结核分枝杆菌潜伏感染中的应用

熊勇超 侯月云 赵建忠 郭晖 何广学

γ干扰素释放试验在检测结核分枝杆菌潜伏感染中的应用

熊勇超 侯月云 赵建忠 郭晖 何广学

结核病（tuberculosis，TB）是严重危害人民群众健康的呼吸道传染病，被列为我国法定重大传染病之一。据世界卫生组织估计，全球约有1／3人群存在潜伏性结核感染（latent tuberculosis infection，LTBI），其中感染人群一生中约有5%～10%会发展为活动性结核［1］。我国为结核病高发国家，LTBI数目十分庞大。根据现有资料显示，我国 Mtb感染率为44.5%（结核菌素试验硬结直径≥5mm为阳性）［2］。第五次全国结核病流行病学抽样调查报告显示，我国活动性、涂阳和菌阳肺结核的患病率分别为459／10万、66／10万和119／10万［3］。存在LTBI的人没有明显的症状和体征，也没有传染性，但是一旦机体免疫系统发生变化，其发展为活动性结核的可能性极高，并且会变得有传染性。因此，早期发现和早期预防LTBI是结核病感染控制最有效的措施［4］。目前，国内外对诊断LTBI还缺乏统一的金标准，现阶段用于诊断LTBI的方法主要有2种：结核菌素皮肤试验（tuberculin skin test，TST）和 γ干扰素释放试验（interferon gamma release assays，IGRAs）。前者是目前还在应用中的一种传统的试验方法，后者是一种新型的检测LTBI的方法，国内外对IGRAs检测LTBI已有一定的研究［5－6］，笔者对IGRAs的原理和方法、敏感度和特异度、成本和成本－效益分析，以及在不同年龄和不同免疫状况人群中的应用等方面进行综合评价。

一、IGRAs原理和方法

随着科技的发展，诊断方法不断更新进步。近年来，有一类用于诊断LTBI的新方法进入了人们的视线，即IGRAs。IGRAs的基本原理是：如果机体受到过Mtb感染，当再次接触相同抗原刺激后致使记忆T细胞发生增殖分化并释放出大量γ干扰素（interferon gamma，IFN－γ），然后通过采用酶联免疫吸附或酶联免疫斑点（ELISA或ELISPOT）方法定量检测来诊断LTBI。目前IGRAs主要有两种商业产品：一种是以ELISA试验原理为基础的澳大利亚Cellestis公司生产的 QFT（QuantiFERON－TB）、QFT－G（QuantiFERON－TB Gold）和 QFT－IT（QuantiFERON－TB Gold In－Tube），该产品是通过体外检测经Mtb特异性抗原刺激后致T细胞所释放的IFN－γ的含量来诊断LTBI；另一种是以ELISPOT试验原理为基础的英国牛津Immunotech公司生产的T－SPOT，其通过体外检测经Mtb特异性抗原刺激后能产生IFN－γ的T细胞数量来诊断LTBI。

作者单位：102206北京，中国疾病预防控制中心结核病预防控制中心［熊勇超（北京协和医学院公共卫生学院研究生）、侯月云（北京协和医学院公共卫生学院研究生）、郭晖、何广学］；北京市丰台区疾病预防控制中心（赵建忠）

美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）于2001年提出QFT法作为第一代诊断LTBI的IGRAs［7］，该试验是采用纯化蛋白衍生物（purified protein derivative，PPD）作刺激源，用ELISA检测血液中IFN－γ的含量，从而对Mtb感染做出诊断。之后，FDA又分别于2005和2007年批准使用 QFT－G 和 QFT－IT 来诊断 LTBI［8－9］，QFT－G利用早期分泌性靶抗原6（early secretory antigenic target 6，ESAT6）和培养分泌蛋白10（culture filtrate protein 10，CFP10）作为特异性抗原，刺激感染了Mtb的机体中具有免疫活性的T淋巴细胞产生特异性的细胞因子IFN－γ，并通过ELISA检测IFN－γ的浓度来诊断结核感染。为了提高诊断的特异度，QFT－IT法中还加入了TB7.7的部分多肽，这两种检测方法比第一代QFT更准确，提高了诊断的特异度。FDA于2008批准T－SPOT作为第四种IGRAs方法，其方法以ESAT6和CFP10作为刺激抗原，用ELISPOT方法测定分泌IFN－γ的T淋巴细胞的数量，来判断Mtb感染情况。

二、IGRAs的特异度和敏感度

IGRAs采用结核特异性抗原，刺激感染了Mtb的机体中具有免疫活性的T淋巴细胞产生特异性的细胞因子IFN－γ，通过检测IFN－γ的浓度来诊断Mtb感染。QFT从第一代采用PPD，第二代使用ESAT6和CFP10，到第三代运用ESAT6、CFP10和TB7.7作为特异性抗原，QFT检测LTBI的特异度也不断提升。此外，IGRAs敏感度也并不低，目前采用不同检测手段诊断LTBI的Meta分析得出结论：在诊断LTBI时，IGRAs的敏感度至少达到和TST一样高［6］。Pai等［10］的一项Meta分析的研究中显示，对于LTBI低风险的人群中，QFT－G和QFT－IT在非免疫人群中的特异度为99%，在BCG免疫人群中的特异度为96%，T－SPOT合并特异度为93%，与之比较，TST在非免疫人群中的合并特异度为97%，而在BCG免疫人群中的特异度仅仅为59%。Higuchi等［11］在47例确诊的结核病患者和84名健康的人群中比较QFT－G和T－SPOT两种检测LTBI的方法，评价了两者的敏感度和特异度，QFT－G和T－SPOT的敏感度分别为87.2%和100.0%，两者的特异度分别为98.8%和83.3%。结果显示，QFT－G的特异度优于T－SPOT，而敏感度不如后者。

国内外许多研究中已经对IGRAs的敏感度进行了评价，直到目前IGRAs较TST更准确，敏感度至少达到了TST的敏感度。在Kampmann等［12］的一项前瞻性研究中，调查的209例儿童中活动性肺结核和LTBI分别为91和118例，研究者对受试对象分别采用 TST、QFT－IT和T－SPOT方法，结果显示，对于痰培养确诊的活动性肺结核TST、QFT－IT 和 T－SPOT 的敏感度分别为 83%、80% 和58%。在埃塞俄比亚开展的一项研究，研究者在107名受试者人群中评价QFT－IT，其中包括31例痰培养阳性和76例痰培养阴性，使用厂家推荐的阳性临界值（≥0.35IU／ml），检测敏感度为 57.1% （20／35），然而其特异 度 为 36.8%（28／76）。如果IFN－γ的临界值采用≥0.1IU／ml，其检测的敏感度可增加至77.4%［13］。Soysal等［14］对100例未进行过治疗的培养阳性的空洞性结核病患者及47例健康志愿者进行对照研究，研究结果表明，当QFT－IT临界值为0.818 IU／ml时，特异度最高，敏感度却没有明显降低。厂家推荐QFT的临界值为≥0.35IU／ml，是由 Mori等［15］在日本研究119例活动性肺结核及216名健康对照时设定的。Lee等［16］的研究发现，当临界值界定为≥0.13IU／ml时，敏感度从70.1%增加到86.2%，而特异度从91.6%降低为86.2%。土耳其有一项评价用于诊断LTBI的IGRAs临界值界定研究，发现当临界值界定为≥0.1IU／ml时，试验的敏感度增加了13.8%［14］。对赞比亚成年人的一项研究显示，当临界值界定为≥0.13IU／ml时，检测的敏感度从74%增加到82%，同时指出当临界值定为≥0.2IU／ml时，敏感度增加了10%［17］。因此，根据目前厂家推荐的高临界值，QFT检测结果也许存在假阴性结果，有必要在不同环境、不同人群、不同国家及不同结核病负担地区开展界定新的临界值的研究，低的临界值用于暴露于结核病患者可能性高者，对于可能性低者，就采用高的临界值。

目前，由于LTBI的诊断缺乏金标准，要想非常准确地评价IGRAs诊断LTBI的敏感度和特异度是很难做到的。但是从上述研究可以看出，在诊断LTBI时IGRAs比TST的特异度更高，而且敏感度并不比TST低，能有效地区分LTBI与健康人群，为LTBI的诊断提供可靠的依据。我国为结核病高负担国家，人群BCG接种率高，采用IGRAs对LTBI的筛查及对结核病的预测尤其重要。

三、IGRAs成本及成本－效益评价

TST诊断LTBI的突出优点是价格低廉，相对而言，由于IGRAs试验试剂盒依赖进口且费用较贵，我国对流动人口、密切接触者和HIV感染者等高风险人群进行LTBI筛查时，是否可以推广单用IGRAs或者推广其作为TST阳性者二次筛查方法，与单用TST相比，三者成本－效果哪项最优，成为其能否在我国推广应用的关键。关于LTBI筛查策略的成本及成本－效益，国内外已有一定的研究。Nienhaus等［18］进行了结核病筛查方法的成本及成本－效益的系统综述的研究，综述包括13篇相关研究，其中5篇文献仅仅考虑了筛查的成本，8篇文献分析了不同筛查方法的成本－效益研究，所有的13项研究发现当使用IGRAs筛查方法时，成本均有所降低。6篇文献比较了两阶段TST／IGRAs（即TST阳性人群中使用IGRAs方法）与单用IGRAs筛查方法，其中4篇文献显示两阶段TST／IGRA成本－效益好，另外2篇文献单用的IGRAs筛查方法成本－效益更优。已有的研究已经充分证实对医务人员、来自结核病高负担国家的移民和密切接触者等高风险人群使用IGRAs进行TB筛查是最符合成本－效益原则的。

Diel等［19］的研究显示，与TST单用检测方法相比，TST／QFT两阶段方法成本更低。单用TST方法比单用QFT方法检测成本高48.6%。对所有接触者进行TST／IGRAs两阶段筛查策略是成本最低的。陈群飞等［20］的IGRAs筛查LTBI的成本－效果分析研究显示，T－SPOT试验总成本最高，TST试验次之，TST和T－SPOT联用总成本最低；预防1例活动性结核，TST与T－SPOT联用所致的增量成本最小，T－SPOT试验次之，TST试验最高；患病率、TST试验效果指标会影响成本－效果，但联用成本－效果始终最高。Oxlade等［21］的一项在高收入国家的γ干扰素释放试验与结核病筛查成本－效益分析研究指出，只有在结核病高危人群中，以TST或QFT筛查LTBI是符合成本－效益原则的，TST阳性者在进行QFT筛查是最符合成本－效益原则的。同时Diel等［22］指出为减少结核病疾病负担，在进行LTBI治疗前使用QFT－IT，尤其是在TST筛查密切接触者中结果大于5mm人群中采用QFT－IT检测方法最符合成本－效益原则。我国属于结核病高负担国家，结核感染人群基数大，上述的筛查LTBI的成本和成本－效益研究带来了一些启示，建议在TST阳性人群中选用IGRAs方法作为辅助诊断方法，可以预防结核病的发生，从而减少结核病的疾病负担。

四、IGRAs在不同人群中的应用

与TST检测方法相比，IGRAs有众多的优点：试验操作简单，不需受试者回访，在BCG免疫人群中其特异度明显高于TST等。目前，国内外已开展了IGRAs在成年人、儿童、HIV感染者及免疫抑制等人群中应用的相关研究，如何在不同年龄、HIV感染者及免疫抑制人群中选择准确合适的诊断LTBI的检测方法。

（一）IGRAs在不同年龄中的应用

已有研究证实IGRAs在成人LTBI诊断中的价值。日本相关指南建议：对于18～49岁人群，QFT的诊断价值比TST高；而在大于50岁人群中，QFT的应用有所限制［23］。但是，由于儿童受年龄、病原学确诊率低，免疫系统还未完全形成、近期接种BCG等多种因素影响，在儿童中诊断LTBI尤为困难。时春虎等［24］进行的一项关于IGRAs诊断儿童LTBI的Meta分析研究表明，10篇文献报道了QFT对儿童LTBI的诊断价值，汇总敏感度和特异度分别为40%和87%；4篇文献报道了T－SPOT对儿童LTBI的诊断价值，汇总敏感度和特异度分别为74%和84%；研究指出，IGRAs适用于进一步鉴别诊断儿童是否处于LTBI，不适合儿童LTBI的筛查。有些研究者建议IGRAs用于筛查5岁以上儿童及接种BCG儿童的LTBI诊断，不建议用于5岁以下儿童的LTBI诊断［23，25］。孙琳等［26］在儿童中进行研究结果表明，ELISPOT试验适宜作为儿童TST试验初筛后LTBI诊断的重要辅助检查。由于儿童一旦患上结核病，后果非常严重，死亡率高，严重威胁儿童的生命健康。尽管IGRAs在诊断儿童结核病方面有一定的优势，但是仍需要开展大量研究来确定其在儿童LTBI诊断中的临界值和敏感度。

（二）IGRAs在HIV感染者和免疫抑制人群中的应用

对于诸如合并HIV感染、重症疾病者等免疫抑制人群，TST检测方法缺乏足够的敏感度［27－29］。许多研究已证实IGRAs在HIV感染者及免疫抑制人群中的应用价值，Jones等［30］的一项研究表明，在HIV人群中QFT－IT结果同TST相比与LTBI危险因素相关的可能性更大，QFT－IT试验在HIV感染人群中可能较TST试验更有价值。康振等［31］的一项关于IGRAs诊断艾滋病患者LTBI的Meta分析结果表明，QFT－G的总敏感度和特异度分别为44%和91%，T－SPOT总敏感度和特异度分别为82%和75%，IGRAs适合用于进一步的鉴别诊断艾滋病患者是否处于潜伏感染，不适合结核感染的筛查。Hoffmann等［32］在血液透析患者中评价IGRAs的LTBI诊断研究显示，在血液透析患者中，QFT－IT是一种有效的替代TST诊断LTBI方法。HIV感染者属结核病高风险人群，及时发现和诊断结核病高风险人群的LTBI，是控制结核病在人群中传播的至关重要环节，因此，有必要进一步在HIV感染者及免疫抑制人群中开展IGRAs在LTBI诊断中准确性的相关研究。

小 结

总之，我国是一个结核病高负担国家，在BCG接种率比较高的环境下，用TST试验诊断LTBI容易产生假阳性结果。目前，大量研究已表明IGRAs对BCG免疫和NTM人群的LTBI诊断比TST更具优势，在此人群中IGRAs可替代TST诊断LTBI。尽管IGRAs目前还不能完全取代TST，但是IGRAs在条件允许地区可作为一项重要的诊断LTBI工具。现阶段，有必要进一步在结核病高发地区和高风险人群中评价IGRAs的应用，从而更加及时准确地发现和诊断LTBI和活动性肺结核，这对控制Mtb感染具有十分重要的意义。

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2012－06－20）

（本文编辑：范永德）

重大传染病防治项目“结核病感染控制新技术平台的研究”（2009ZX10004－714）；中美新发与再发传染病合作项目（子项目16）

何广学，Email：heguangxue＠chinatb.org

注：熊勇超与侯月云并列第一作者