急性鼻窦炎大鼠黏膜一氧化氮合酶的组织化学变化

许必芳 袁晓辉 朱天明 曾秀燕 熊大经

一氧化氮(NO)在体内是一种含自由基的气体,易扩散、不稳定、半衰期极短,仅为数秒;而在大气中则是有害的化学物质,但近年来许多研究表明极少量可调控的NO却充当生理和病理调节介质,是一种新型的细胞内信使分子和效应分子,广泛参与机体循环,呼吸,消化和神经等各个系统的生理和病理调节,在炎症和免疫反应中发挥着重要作用[1]。

1 材料与方法

1.1动物SD大鼠90只,一级动物,体重150～200g,青年,雌雄各半,华西医科大学实验动物中心提供,合格证号:川实动管第70号。

1.2药品与菌株

鼻渊舒口服液实验制剂:成都中医药大学华神集团生产。青霉素V钾片:长春市新安制药厂生产,批号:133589。稀化粘素(吉诺通胶囊):德国保时佳大药厂生产,进口注册证号:X980578。盐酸氯安酮注射液:上海第一制药厂生产,批号:980701。盐酸利多卡因注射液:北京万辉药业集团生产。批号:京卫药准字(1998)第104094号。肾上腺素:上海禾丰制药有限公司生产,批号:01004。金黄色葡萄球菌标准菌株(ATCC):四川省卫生干部学院微生物教研室研究制备,批号:25935。

1.3器械

骨穿针:6号,天津市医用仪器设备厂生产。高倍显微镜:OLYMPUS AX80型,日本生产。

1.4造模与分组

将大鼠按体重、性别随机分为九组,每组十只。分别为空白组、模型组、假模型组、鼻渊舒口服液低剂量组、鼻渊舒口服液中剂量组、鼻渊舒口服液高剂量组、西药1组、西药2组、中药+西药组。其中空白组不做任何处理,假模型组为给大鼠双侧上颌窦分别注入0.1ml生理盐水,其余组别为给大鼠双侧上颌窦分别注入0.1ml金黄色葡萄球菌混悬液(109CFU)。造模7天后开始给药,给药时间为7天。给药方法为鼻渊舒口服液低剂量组:每日以临床成人剂量5倍的鼻渊舒口服液(浓度为0.81925g/ml)2～3ml灌胃,分早晚二次灌服。鼻渊舒口服液中剂量组:每日以临床成人剂量10倍的鼻渊舒口服液(浓度为1.63185g/ml)2～3ml灌胃,分早晚二次灌服。鼻渊舒口服液高剂量组:每日以临床成人剂量20倍的鼻渊舒口服液(浓度为3.2637g/ml)2～3ml灌胃,分早晚二次灌服。西药1组:每日以临床成人剂量5倍的青霉素V钾制成混悬液(含药量相当于10mg/kg.d)灌胃,分早晚二次灌服。西药2组:每日以临床成人剂量5倍的稀化粘素制成混悬液(含药量相当于10mg/kg.d)灌胃,分早晚二次灌服。中药+西药组:每日以临床成人剂量5倍的鼻渊舒口服液(浓度为0.81925g/ml)2～3ml和含药量相当于10mg/kg.d的青霉素与稀化粘素灌胃,分早晚二次灌服。模型组,假模型组:每日以与用药组等容的生理盐水灌胃。空白组:正常喂养,不灌胃。

1.5标本采集与切片制备

用药7天结束后,对实验动物进行轮流处死,并立即取其鼻黏膜,放4℃冰箱保存,待所有组织取完后,用多组织合包方法[2]进行组织处理,并浸入-170℃液氮内保存,经-15℃恒冷切片机连续切片,片厚10u,吹干后冷丙酮(4℃)固定5分钟,作NADPHD标准脱氢酶组化染色[3]。染色强度采用目测半定量法观察[4]。即细胞质呈深蓝色为强阳性反应,蓝色为阳性反应,浅蓝色为弱阳性反应,着色与背景相同为阴性反应。

2 结果

鼻黏膜经NADPH-脱氢酶染色后,不均等分布于浆液腺、黏液腺细胞质,粘膜上皮及少许血管内皮细胞质。空白组、假模型组、鼻渊舒中剂量组鼻黏膜染色为浅蓝色,采用目测半定量法定为弱阳性;鼻渊舒低、高剂量组,西药1组染色都比空白组颜色深,比模型组颜色浅,采用目测半定量法定为阳性,且其颜色依次加深;西药2组,中药+西药组的染色与模型组的颜色非常接近,比空白组颜色深,采用目测半定量法定为强阳性。

3 讨论

1980年,Furchgott等用兔胸主动脉实验时偶然发现乙酰胆硷的舒血管反应需依赖于血管内皮细胞的存在,才能作用于毒覃硷样受体发挥效应,并在随后的研究中,把诱导血管松弛的内皮细胞产生的介质命名为内皮细胞舒血管因子(EDRF)[5]。1986年,Furchgott和Ignarro分别提出EDRF就是一氧化氮(NO),1987年,Palmer等用化学发光法证明内皮细胞可以产生NO,并证实EDRF就是NO。其作用机理是NO生成后可使鸟苷酸环化酶生成cGMP(环鸟苷酸环化酶),cGMP作为第二信使参与上述各种作用,NO作用后与血红蛋白结合为高铁血红蛋白,代谢排出。

NOS广泛分布于人体多种细胞、组织和器官。鼻黏膜的神经支配来源于翼腭神经节和颈上神经节。Hanazawa等于1993年首先用尼克酰氨腺苷二核苷酸磷酸(NADPH)-黄递酶组织化学染色法测定大鼠鼻黏膜,发现其免疫阳性纤维围绕血管、腺体和上皮下层周围,翼腭神经节的许多神经元被标记,三叉神经节的少量神经元亦被染色,颈上神经节神经元阴性,说明NOS免疫阳性纤维主要起源于翼腭神经节[6]。Hanzawa等于1997年又用NADPH-黄递酶组织化学染色法证明人鼻黏膜的阳性纤维分布在血管和黏膜下腺体周围,翼腭神经节的神经元亦为阳性[4]。iNOS位于鼻窦炎患者的表层上皮细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞和炎症细胞,轻微炎症的标本显示了在表层上皮细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和鼻腔腺体上的集中染色,在炎症程度和在表层上皮细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞、腺体上的iNOS免疫反应之间有明显相关性。

急性鼻窦炎的病理特点是黏膜水肿,炎性细胞浸润,上皮细胞增殖。它作为一个炎性组织的代表,上皮细胞应答炎症反应,而诱发iNOS的大量表达,以及由此导致NO的大量释放,引起一系列的血管反应。给药后,减少了大鼠鼻部的炎症反应,减轻了鼻窦、鼻腔的缺氧状况,从而使NOS的表达降低。在炎症的发展过程中,自始至终都有炎症介质的释放。NO是呼吸道的重要炎症介质,上呼吸道的上皮组织是NO产生的源泉。针对NOS,我们推测鼻渊舒口服液治疗大鼠实验性急性鼻窦炎的作用机理可能是:鼻渊舒口服液降低急性实验性鼻窦炎大鼠鼻黏膜中NOS的酶活性,抑制炎症介质NO的产生和释放,从而减轻炎症反应,促进急性鼻窦炎的康复。

[1] 钟慈声.孙安阳 一氧化氮的生物医学[M].上海:上海医科大学出版社,1997.

[2] 李琼英.多组织合包技术在毒理实验酶组织化学中的应用.四川医学会卫生学会第11界毒理学学术讨论会会议交流资料,1985:118-119

[3] Lojda Z[J].Histochemistry,1979,59:153-159

[4] 黄登清,等.兔急性上颌窦鼻黏膜一氧化氮合酶的组织化学变化[J].福建医科大学学报,2002,36(1):52-53

[5] 汪显阳.一氧化氮合酶抑制剂的研究进展[J].海峡药学,2001,13(4):1-5

[6] Hanazawa TH,et al[J].Neurosci Lett,1993;159:71-74.