树突状细胞疫苗的现状与未来

邵惠训

1868年，Langerhans 首先在人体皮肤的表皮层发现了树突状细胞，当时称之为Langerhans 细胞。1973年，Steinman 从小鼠脾脏分离出这种细胞，正式命名为树突状细胞（dendritic cells，DC）。DC 在抗肿瘤、抗感染、移植排斥、变态反应性疾病和自身免疫性疾病治疗中具有广阔的应用前景[1-2]。由于这种细胞的发现，Steinman 获得了 2011年诺贝尔生理医学奖并被誉为树突状细胞之父。DC是人体内最活跃、功能最强的专职抗原递呈细胞（antigen-presenting cells，APC）。未成熟的DC 广泛分布在人体各种组织器官，人体对抗原异物产生免疫反应，必须先经过 APC 识别、加工和处理。当人体受病原因子刺激后，DC 迁移至次级淋巴组织，并逐渐成熟。它在人体内数量极少，但具有很强吞噬能力，能高效地摄取、加工处理和递呈抗原。在DC 表面存在很多种抗原递呈分子，如组织相容性复合物（major histocompatibility complex，MHC）I、II抗原，能表达多种共刺激分子（如 CD80/B7-1、CD86/B7-2、CD40、CD40L）、黏附分子（如 ICAM-1、ICAM-2、ICAB-3、LFA-1、LFA-3）和整合素（integrin）等。DC 受细胞因子调控同时，也能分泌多种淋巴因子，如 IL-1、IL-6、IL-12、IL-18、IFN-α、转化生长因子-α（transforming growth factor-α，TGF-α）和颗粒细胞/巨噬细胞-集落刺激因子（granulocyte/macrophage-clony stimulating factor，GM-CSF）等，从而诱导初级免疫反应，活化初始型 T 细胞。成熟的DC 通过趋化因子受体的表达，向淋巴组织和淋巴器官归巢。成熟的DC 在次级淋巴器官通过 MHC-I、II 类分子，将抗原信息递呈给 T 细胞，激发特异性细胞免疫应答。DC是人体免疫系统的重要组成部分，是免疫反应的启动者和调控者，是连接天然免疫和特异性免疫的桥梁，用来加强免疫反应不足或削弱过强的免疫反应。

1 DC的生物学特性

人体内的DC 处于未成熟状态，未成熟的DC 在摄取抗原或受某种因素刺激后，即分化为成熟的DC。DC 在成熟过程中，由接触抗原的外周组织迁移至次级淋巴器官，与T 细胞接触，激发免疫应答，发挥免疫监视功能，并诱发免疫耐受，调控器官移植后的排斥反应[3-5]。

DC 具有激活 CD8+、CD4+和细胞毒性 T 细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）的能力，增强人体细胞免疫和体液免疫，在免疫应答中处于核心地位。DC 按其来源可分为髓系 DC（myeloiddrived DC，MDC）和淋巴系 DC（lymphoidrelated DC，LDC），均起源于多能造血干细胞（multiple hematopoietic stem cell，MHSC）。两种DC 担负着共同使命。髓系 DC 来源于骨髓 CD34+ 造血祖细胞，主要分布在T 细胞富集区，专职递呈自身抗原与MHC 复合物，强烈刺激 T 细胞免疫反应，并分泌 IL-12，调节 T 细胞和NK 细胞功能。促进 Th0 朝 Th1 方向分化，递呈凋亡细胞肽片段。淋巴系 DC 与T 细胞、B 细胞和NK 细胞具有共同前体细胞，可被病毒诱导快速产生 IFN-α/β/γ，促进 Th2 分化，递呈凋亡细胞肽片段。主要分布在淋巴结、脾脏、黏膜相关组织中的淋巴滤泡生发中心具有较强激活B 细胞的能力，但抗原递呈能力很弱。

DC 由于其异质性和可塑性而具有双重功能。人体 DC又可分为DC1和DC2 两个亚群。DC1 与单核细胞、颗粒细胞有共同祖细胞，能分化成巨噬细胞。DC1能产生IL-12、TNF-α和少量 IL-6，诱导 Th0 向 Th1 分化。DC2与T 细胞、NK 细胞有共同前体细胞。DC2能分泌 IL-6和少量 IL-12，诱导 Th0 向 Th2 分化。DC2 通过诱导 Th2型反应，而抑制 Th1 型应答。Th2 型反应产生的IL-10能影响 DC 成熟，减少其 MHC II 类分子、共刺激分子和黏附分子的表达，并诱导调节性 T 细胞分化和T 细胞无反应性，进而诱导免疫耐受。免疫耐受的产生可能与选择性激活 Th2亚群有关。

2 DC的分离与培养

DC 从血液循环的造血祖细胞分化而来，骨髓、脐带血和外周血干细胞、外周血单核细胞都可作为前体，诱导分化而成 DC。用 GM-CSF 刺激，诱导 DC 前体扩增，促使其分化。用 GM-CSF和IL-4、IL-3 同时刺激，会使未成熟的DC 迅速成熟，提高细胞产量，并提高其抗原递呈能力。

采集志愿者外周静脉血，经肝素抗凝，超高速密度梯度离心分离出淋巴细胞。在GMP实验室用 RPMI 1640 培养基进行单核细胞培养。单核细胞与GM-CSF和IL-4 共同培养，7 d 后使其分化为DC。吸去培养液，加入含有 IFN-α的RPMI 1640 培养液，继续在5% CO2温箱 37 ℃ 培养，第 9 天可获得成熟的DC。脐带血 CD34+ 细胞经GM-CSF、TNF-α、早期细胞生长因子、FL和促血小板生长因子（TPO）扩增诱导，也能获得大量 DC。

将骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）和成熟的DC 共培养。MSCs 抑制 DC 发育和成熟，阻止DC 凋亡，促使 DC 大量增殖，表型发生改变，成为一种短树突状近圆形的细胞，称之为调节性 DC。这种细胞能存活较长时间，具有较强吞噬能力，有较高免疫调节作用，免疫原性却很弱[6]。

应用肿瘤相关抗原（tumor associated antigens，TAAs）或病原抗原冲击强化致敏 DC，制成细胞疫苗，即树突状细胞疫苗，回输到患者体内，用于多种疾病治疗。

3 DC 疫苗的应用前景

3.1 在抗肿瘤领域的应用前景

肿瘤是严重危害人类生命健康的疾病。患病期间缺乏专职抗原递呈细胞有效递呈，导致初始型 T 细胞与肿瘤细胞的相互作用耐受或无能，阻碍 T 细胞介导的抗肿瘤免疫有效激活[7]。细胞性肿瘤抗原易于获取和制备。将肿瘤相关抗原递呈给 T 细胞受体（T cell receptor，TCR），同时激活CD4+、CD8+、CTL和NK 细胞，并促使 B 细胞分化。通过穿孔素（perforin）、粒酶 B（granzyme B，GB）和Fas/FasL介导途径，激活肿瘤杀伤细胞，从而产生抗肿瘤效应，发挥特异性杀伤肿瘤细胞作用[8]。通过释放抗血管生成物质和前血管生成因子，阻止肿瘤血管形成，加速肿瘤细胞凋亡。

分子生物学技术的发展和基因工程技术的应用，使核酸扩增成为可能。通过核酸扩增、差异筛选等获得肿瘤细胞mRNA。基因转染 DC 可持续表达肿瘤抗原肽。DC 还能通过吞噬凋亡的肿瘤细胞取得抗原。将肿瘤抗原肽或 TAAs与自身或同种异体 DC 共育，DC 与肿瘤抗原结合，可激发抗肿瘤效应。将此 DC 回输给患者，能调动机体的免疫功能，将藏匿在人体内的肿瘤细胞清除出去，可预防肿瘤扩散、复发和治疗肿瘤。

DC 免疫疗法在治疗肾癌、脑瘤[9]、恶性黑色素瘤、前列腺癌、胰腺癌、恶性胶质瘤和妇科肿瘤[10]的研究中，都取得了显著进展。2006年，Steinman 患晚期胰腺癌，他用自己创建的免疫疗法治病。用携带癌胚抗原（CEA）基因决定簇的重组腺相关病毒（r-adeno-associated virus，r-AAV）感染 DC，感染的DC能刺激产生高效杀伤 CEA 阳性肿瘤细胞的特异性 CTL，将此 CTL 回输到自己体内，生命延长了 5年。

2010年5 月，美国食品药品监督管理局批准的第一个癌症治疗疫苗——前列腺癌疫苗，就是用 DC 制备的。

3.2 在抗感染领域的应用前景

荷载病原抗原的DC 具有细胞疫苗的功能。用病原抗原体外冲击致敏 DC，然后回输给患者，能有效激活人体免疫细胞。利用病原载体将带有病原体抗原的编码基因转染DC，使 DC 持续表达特异性抗原，能诱导人体产生抗感染效应，产生 CTL，从而杀伤病原体感染的细胞。在抗细菌[11]、抗病毒（包括慢性乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病、EB 病毒相关肿瘤和巨细胞病毒感染）[12-18]、抗真菌和抗寄生虫病[19]的研究中都有一定进展，有待进一步深化。

DC 不仅是人体内重要的抗原递呈细胞，也具有免疫调节作用。在人体免疫失衡、免疫抑制和病原微生物在体内扩散中的作用也受到人们关注。DC 可启动免疫反应，也能反向调控免疫反应。DC 参与了脓毒症和多器官功能障碍综合征免疫系统损伤的启动，引发免疫功能紊乱。儿童和老人的细菌性肺炎是常见危重疾病。在疾病中过度成熟与活化的DC，造成 IL-12 过量分泌，TNF-α、IL-6 促炎细胞因子分泌过多，免疫反应超强，使肺炎向重症发展。在这种情况下，DC 疫苗就需要进行反向调节。

慢性乙型肝炎患者 DC 功能缺失，是慢性乙型肝炎迁延不愈的重要原因[20]。提高慢性乙型肝炎患者 DC 功能，诱导强烈的HBV 特异性免疫效应，才能清除体内病毒。将细胞因子诱导杀伤细胞（cytokine induced killer cell，CIK）与HBsAg 冲击致敏 DC，共育后回输到患者体内，有效增强其对 HBV 感染细胞的杀伤作用。将 IgG1的重链 Fc段基因与HCV 抗原基因融合，构建融合基因疫苗。将融合Fc 基因的HCV 基因疫苗转染 DC，可用于慢性丙型肝炎治疗。用 EB 病毒膜抗原 gp340 冲击致敏 DC，能激发人体 CTL，杀伤 EB 病毒相关肿瘤细胞。用HPV 16 E6、E7癌基因重组腺病毒载体，转染 DC，制备基因修饰 DC 疫苗，能激发人体 CTL，促使宫颈癌 Caski 细胞凋亡，感染病灶消退。

3.3 在器官移植领域的应用前景

器官移植的成败，取决于排斥反应的防治效果。同种异体移植的排斥反应，是受者免疫细胞对供者抗原产生免疫应答。在器官移植过程中，通过各种手段，阻断免疫效应通路，可避免移植排斥反应发生。有研究证实，用 GM-CSF和IL-4 诱导未成熟 DC 成熟，在体外能抑制效应性 T 细胞，有利于免疫耐受的形成和维持[21]。以腺病毒或逆转录病毒为载体，将具有诱导免疫耐受的抑制分子的靶基因转染供体DC，并使其表达，从而阻断抗原递呈，减轻排斥反应，延长移植物存活时间。

3.4 在变态反应性疾病领域的应用前景

变态反应性疾病（allergic disease）是一种对过敏原免疫耐受缺陷的疾患。近半个世纪以来，变态反应性疾病发病率持续升高，与CD4+ T 细胞分化异常有关，Th 在发病中起关键作用[22]。过敏原进入人体，被巨噬细胞捕获，巨噬细胞对过敏原进行消化处理，将抗原表位决定簇传递给 Th细胞并促使其分化，Th2 增多，功能亢进，导致促炎细胞因子释放，再传递给 B 细胞。B 细胞发生分裂，释放出IgE，IgE 与人体自身的肥大细胞和血液循环中的嗜碱性细胞的Fc 高亲和力受体（FcεR I）结合，肥大细胞发生脱颗粒，并释放炎性介质，促使人体致敏。肥大细胞主要分布在皮肤、黏膜和毛细血管周围，当人体再次接触这种过敏原时，过敏原就会与致敏细胞上的IgE结合，促使细胞释放出组胺、5-羟色胺（5-hydroxy tryptamine，5-HT，又称血清素，serotonin）和缓激肽（bradykinin，BK）等活性物质，导致变态反应性疾病（如哮喘、变应性鼻炎、异位性皮炎和荨麻疹等）发生。DC 疫苗能抑制或阻断 IgE 与FcεR I结合，起到免疫调节作用，有利于免疫耐受形成，缓解变态反应发生。

3.5 在自身免疫性疾病领域的应用前景

德国 Ohnmacht等[23]报道，敲除了 DC 基因的小鼠，多数发生自身免疫性疾病。将 CD11c-Cre 转基因小鼠与白喉毒素（diphtheria toxin A，DTA）转基因小鼠杂交，产生子代小鼠，体内 DC 被清除。由于DC 缺失，小鼠胸腺中CD4+ T 细胞明显增多，外周组织CD4+ T 细胞浸润。小鼠发生严重自身免疫性疾病，表现为体重减轻，脾脏肿大，自身抗体升高，中性颗粒细胞减少，Th1和Th17 细胞增多和肠炎等。将此小鼠骨髓植入正常的小鼠，可诱发上述病理性反应[24]。胸腺内的耐受性 DC（tolerogenic DC，tDC）能清除自身反应性 T 细胞，从而诱导免疫耐受[25]。DC 参与中枢免疫耐受的诱导。外周血 DC 可携带外周抗原进入胸腺，也参与外周血免疫耐受的诱导。回输经体外 IFN-β和IL-10 共培养的自体 DC，可治疗多发性硬化症等自身免疫性疾病。

4 结语

树突状细胞疫苗是当今研究最活跃，研究成果最丰硕的疫苗治疗课题。DC是一类与人体免疫功能密切相关的淋巴细胞，表面具有许多树枝样的膜突起。广泛分布于血液、肝、脾、淋巴结和其他非免疫器官中。成熟的DC 高表达 MHC分子、协同刺激分子、黏附分子和整合素等，并分泌多种趋化因子和细胞因子，通过抗原递呈，第一信号、第二信号和第三信号系统，直接激活初始型 T 细胞，激活人体免疫功能，并诱导免疫耐受。其中第一信号来自DC 表面的抗原肽，MHC 分子复合物与T 细胞相应受体结合；第二信号来自DC 上的协同刺激分子与T 细胞表面的相应受体结合；第三信号来自DC 分泌的IL-12，促进 Th0 向 Th1 分化，或 DC 不分泌 IL-12，介导 Th0 向 Th2 分化。DC 可启动免疫反应，也能反向调节免疫。DC 疫苗既能加强癌症和感染性疾病中不足的免疫反应，也能减弱器官移植、变态反应性疾病、自身免疫性疾病和某些病毒感染中过强的免疫反应。DC的复杂性使得合理的免疫调节十分必要。DC 受相关抗原冲击致敏后，具有细胞疫苗功能。在肿瘤免疫、抗感染免疫、移植免疫、自身免疫和免疫耐受中扮演着越来越重要的角色。DC 疫苗的安全性非常好，至今未有严重不良反应的报道。随着对 DC 疫苗深入研究，必将进一步推动免疫学的发展。

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