热休克蛋白-肽复合物与肿瘤免疫

牛保华，齐义军，晁玮霞，马远方

热休克蛋白（heat shock protein，HSP）是一类在生物进化过程中高度保守，广泛表达于所有生命机体组织细胞并具有管家功能的蛋白质。根据分子量的差异，HSP 可分为10个家族，包括 HSP110/grp170、gp96/grp94、HSP90、HSP70/grp78、HSP65、HSP25/27等，每个家族有 1～5个成员[1]。在正常生理状态下，HSP的结构性表达约占细胞蛋白质组的5%。HSP 作为分子伴侣，参与蛋白折叠、蛋白降解、蛋白复合体组装、转运、抗原处理、蛋白定位等生物学过程。高温、毒素、氧化、糖原耗竭等应激状态可诱导 HSP的表达上调，高表达的HSP 可达细胞蛋白质组的15%，增加的HSP能够快速短暂地保护细胞免受损伤，增加细胞的修复功能，维持应激状态下细胞中关键分子通路的完整性[2]。近年来发现 HSP 与肿瘤免疫密切相关，本文就 HSP-肽复合物抗肿瘤的分子免疫机制及以 HSP 为免疫佐剂的肿瘤疫苗作一综述。

1 HSP-肽复合物免疫原性

某些 HSP能够结合细胞内降解的许多肽段构成 HSP-肽复合物，如位于胞浆的HSP90和HSP70 及位于内质网的gp96、calreticulin、HSP110和HSP170。HSP-肽复合物相当稳定，可以耐受常规的生化、物理分离纯化过程，HSP-肽复合物通常携有大量的非共价结合的多肽分子[2]。因此，热休克蛋白相结合的肽库在一定程度上代表了其来源组织细胞的蛋白构成。

HSP-肽复合物具有免疫原性，从肿瘤或病毒感染的组织细胞中分离纯化的HSP能够刺激机体产生特异性免疫应答反应，而来源于正常组织的HSP 却没有这种功能。HSP-肽复合物的抗肿瘤活性起始于gp96，之后发现HSP70、HSP90、calreticulin、HSP110 及GRP170 均具有这种特异的免疫防御功能。从 HSP 中解离出其结合的多肽分子后，会导致 HSP 免疫保护功能完全丧失，体外重组的HSP-多肽复合分子具有相同的免疫保护功能[3]。越来越多的证据充分证实：HSP的免疫原性来源于HSP结合的肿瘤或病毒感染的细胞内蛋白降解生成的多肽，而不是 HSP 分子本身所具有的功能，从肿瘤组织细胞分离纯化 HSP的生物化学过程并没有影响到 HSP的分子伴侣功能[4]。在免疫原性方面，gp96和HSP70 诱导的免疫保护反应强于其他的HSP 分子，而 gp96 在诱导机体抗原特异性细胞毒淋巴细胞（CTL）反应能力方面优于其他同类分子[3]。

2 HSP-肽复合物诱导肿瘤特异性免疫的分子机制

一般来讲，内源性抗原是通过 MHC I 类分子提呈，外源性抗原通过 MHC II 类分子提呈。在HSP-肽复合物诱导肿瘤特异性免疫反应过程中，HSP 发挥了中转作用，对细胞浆来源的多肽进行处理后转运至内质网，然后介导 MHC I 类分子与抗原肽结合，属于抗原交叉提呈范畴[5]。最近的研究表明：抗原呈递细胞（antigen-presenting cells，APC）表面的HSP 受体，如 CD91、LOX1、SR-A等，在识别与内吞 HSP-抗原肽复合物、抗原的交叉呈递至 MHC 分子过程中起着关键作用。gp96-肽复合物并不能直接激活 T 细胞，而是通过巨噬细胞、树突状细胞（dentritic cells，DC）及B 细胞等 APC 表面的CD91 受体介导，受体-gp96-抗原肽复合物被内吞后进入 APC的内体，内体中的低 pH环境可能促进了抗原肽解离，gp96 与MHC I 类分子的相互作用激活了 gp96的ATP 酶活性，ATP 水解释放的能量使抗原肽由 gp96 转移到 MHC I 类分子[6]。此外，gp96 还能诱导 DC的成熟并同时下调 DC 表面的受体，使 DC失去了与gp96结合的能力，成熟的DC能直接刺激 T 细胞，启动 CTL 效应[7]。

与MHC 类分子类似，HSP能够结合细胞内的抗原肽。但与MHC 分子不同的是，由于HSP 没有多态性，即正常组织与疾病组织中的HSP的基因序列并没有差异。因此，与HSP 相互作用的多肽更广泛、不受 MHC 限制，能结合MHC 类分子之外更多的多肽分子[8]。此外，HSP 还能促进APC的表型和功能成熟，如 HSP 刺激后DC 表面 MHC II 类分子、CD86和CD83等分子的表达上调，以及细胞因子和化学因子等前炎症因子的分泌增加[2,9]。HSP70-和gp96-肽复合物还能刺激自然杀伤细胞增殖并使其激活[10]。因此，HSP 分子除了担当抗原肽的载体，还具有免疫佐剂的免疫刺激功能，同时诱导天然性和适应性免疫应答，故HSP 用于肿瘤的免疫治疗具有无可替代的优势。

3 HSP-肽复合物肿瘤疫苗及临床应用

由于HSP 介导的抗肿瘤效应来源于其结合的抗原肽，因而体外重组的HSP-抗原肽复合物亦能激发机体产生类似的特异性的肿瘤清除反应。与MHC 分子结合的多肽分子不同，HSP结合的多肽非常广泛，不受抗原肽表位的影响，因而具有广阔的应用前景[2]。由 gp96 介导的免疫反应所需多肽的量极少，研究表明 1～2 ng人工合成的多肽与gp96结合后，一方面既可交叉呈递给 MHC I 类分子启动CD8+ T 细胞反应，另一方面还能提呈抗原到 MCH II 类分子，最终刺激机体产生有效的肿瘤特异的免疫反应[3,5]。

故而，基于HSP-多肽复合物的肿瘤特异性疫苗为肿瘤免疫治疗提供了广阔的应用前景，其具有 3个显著的优点：①HSP 介导的免疫杀伤作用并不需要对免疫性多肽的表位进行鉴定，而临床上肿瘤患者有着不同的个体差异，这样就免除了对不同类型和不同个体的肿瘤的免疫保护抗原进行鉴定的必要；②来自于肿瘤的HSP-抗原肽复合物包含有大量不同的免疫原性多肽，因而其介导的免疫防御反应针对的是肿瘤组织细胞中所有特异的抗原库，降低了免疫逃逸发生的可能性；③同一种属内 HSP 没有多态性，不受 MHC I类抗原限制，可在同种内广泛应用。在小鼠和大鼠的肿瘤模型中，当 HSP 复合物介导的免疫治疗作为辅助手段时，在肿瘤被完全切除之后，所有的接受 HSP 复合物免疫治疗的动物在整个实验过程中都能保持无瘤状态；但对没有切除、进展性的肿瘤，仅能维持肿瘤的稳定，仅少数病例可见肿瘤实体的缩小[2]。

基于HSP-多肽复合物的广谱抗肿瘤活性，这种辅助治疗手段的适应症包括了各种组织类型的肿瘤。目前已有多个应用自体纯化的HSP-肽复合物对肿瘤进行免疫治疗的I和II 期临床试验，具有一定的疗效。gp96-肽复合物疫苗已应用于多种不同组织类型的肿瘤，如胰腺癌、胃肠道肿瘤、淋巴组织肿瘤、慢性骨髓性白血病、肾癌及皮肤的黑色素瘤等[11]。

自最初发现 gp96-肽复合物抗肿瘤活性后，已有许多自体肿瘤组织 gp96-肽复合物提取物对肿瘤患者治疗的临床试验。应用自体肿瘤 gp96-肽复合物提取物治疗黑色素瘤患者的临床 II 及III 期试验，目前已有 4 篇报道。di Pietro等[12]综合分析后发现：自体免疫后肿瘤特异性 CTL 反应增强患者的预后显著好转，gp96-肽复合物与其他免疫治疗方案结合后疗效更为显著。20 例晚期黑色素瘤已发生多处转移的患者，25 μg 自体 gp96-肽复合物皮内注射作为黑色素瘤辅助治疗，经过 10年随访 11 例IV 期患者发现：45%的患者疾病没有进展，10年整体生存率为82%[13]。对发生了肝转移的29 例结肠癌患者，应用手术切除的肝转移灶标本制备自体 gp96-肽复合物肿瘤疫苗，经过两个周期的治疗，患者外周血淋巴细胞的酶联免疫斑点法（ELISPOT）检测显示：15 例（52%）患者激发了新的HLA I 限制性特异性杀伤结肠癌细胞的CTL 反应或原有的CTL 反应显著增强；同时，这些患者外周血中 CD3+、CD45RA+和CCR7-T 淋巴细胞明显增加；结肠癌特异性 CTL 反应增加患者无瘤生存期较无反应者明显延长[14]。国内学者也应用HSP-肽复合物治疗 32 例原发性肝癌患者，结果显示：治疗 3个月后，治疗组的CD3+、CD8+ 细胞明显升高，CD4+/CD8+ 细胞的比值下降，NK 细胞的活性也较治疗前显著增强；治疗组的3年生存率为68.8%，较对照组的37.5% 明显升高[15]。此外，还有学者利用 DNA-HSP65 肿瘤疫苗治疗晚期头颈部鳞癌，21 例患者被分为3组，分别接受 3个剂量瘤体内注射，治疗一个周期（3周）后，发现 4 例可检测到外周血淋巴细胞分泌 IL-10 增加，5 例患者治疗后病情稳定或肿瘤消退，2 例完成治疗的患者 3年后仍存活，提示 HSP是肿瘤治疗的新靶点，具有美好的应用前景[16]。也有学者应用 gp96-肽复合物免疫治疗神经胶质瘤患者，无论是对于复发还是新近诊断的胶质瘤患者，治疗组的中位生存期均从 26周增至 44周。

目前为止已完成了多个 HSP-多肽复合物治疗多种肿瘤临床试验，但均不是随机临床试验；尽管如此，肾癌、胰腺癌和黑色素瘤的HSP-多肽复合物免疫治疗显示了较好的临床疗效，与动物模型观测的结果一致[2]。以上结果提示HSP-肽复合物肿瘤疫苗能有效地治疗特定肿瘤、降低术后复发率。

4 重组多价 HSP-肽复合物肿瘤疫苗

然而，个体化的HSP-肽复合物肿瘤疫苗并不适用于所有的肿瘤患者，尤其是无手术机会及术后复发转移的晚期患者，肿瘤患者不能提供足够肿瘤组织以制备自体肿瘤疫苗，供自体长期治疗使用。其次，肿瘤组织来源有限，繁杂的纯化制备过程难以标准化及质量控制，既是制备自体疫苗所面临的挑战，还阻碍了其大规模生产。第三，HSP-抗原肽复合物半衰期较短，阻止了肿瘤疫苗的长期使用。

相对肿瘤患者自体来源的HSP-肽复合物疫苗，体外重组HSP-肽复合物疫苗具有无可比拟的优点：①HSP 高效结合的肽类分子所构成的复合物疫苗可高浓度刺激机体的免疫系统，启动免疫应答；②HSP 可结合多个具有不同 CTL表位的抗原肽，供个体的抗原提呈细胞的MHC 分子选择，产生针对不同抗原表位的多克隆 T和（或）B 细胞的抗肿瘤效应，降低免疫逃逸的发生；③重组HSP-肽疫苗仍适用于不能提供肿瘤组织的晚期、术后复发癌症患者，尤其适用于肿瘤易患人群或术后高复发转移倾向的患者的预防性治疗；④重组HSP-肽肿瘤疫苗生产成本低，可大规模、高质量的工业化生产；⑤选择不同 HLA 限制性的免疫优势CTL 表位肽构成多价重组疫苗而非整个肿瘤组织或细胞，有益于更好地理解认识重组HSP 疫苗的肿瘤特异性免疫反应的分子机制。

5 结语

由于肿瘤细胞遗传的不稳定性，肿瘤患者确诊时其肿瘤细胞/组织内已发生了约 10000的基因突变等分子事件；由基因突变导致异常蛋白的数量更多。同时，随着肿瘤进展，肿瘤细胞为了适应周围恶劣的微环境，如低氧、酸性环境、肿瘤患者治疗过程中的放化疗等，发生恶性变的细胞需要大量伴侣蛋白的保护功能，使细胞能够继续生存，因而，细胞内伴侣蛋白的表达量整体上调，尤其是 HSP90 家族。与正常组织相比，肿瘤组织不仅表达 HSP的量增加，而且 HSP的伴侣功能增强，如高表达的gp96 与突变异常的靶蛋白和多肽分子亲合力增加，因而 HSP结合的蛋白或多肽构成了肿瘤特异的抗原指纹，奠定了肿瘤免疫治疗的基础。近年来，随着免疫学、计算机学和生物信息学的飞速发展，使筛选优势 CTL 表位肽成为可能。通过鉴定特定肿瘤组织中 HSP结合的多肽抗原指纹图谱，利用分子模拟技术筛选优势CTL 表位肽，体外重组多价 HSP-肽复合物抗原肿瘤疫苗，将会给肿瘤的免疫治疗带来新的希望。

[1]Gething MJ, Sambrook J.Protein folding in the cell.Nature, 1992,355(6355):33-45.

[2]Srivastava P.Roles of heat-shock proteins in innate and adaptive immunity.Nat Rev Immunol, 2002, 2(3):185-194.

[3]Blachere NE, Li Z, Chandawarkar RY, et al.Heat shock protein-peptide complexes, reconstituted in vitro, elicit peptide-specific cytotoxic T lymphocyte response and tumor immunity.J Exp Med,1997, 186(8):1315-1322.

[4]Udono H, Levey DL, Srivastava PK.Cellular requirements for tumor-specific immunity elicited by heat shock proteins: tumor rejection antigen gp96 primes CD8+ T cells in vitro.Proc Natl Acad Sci U S A, 1994, 91(8):3077-3081.

[5]Srivastava PK, Udono H, Blachere N, et al.Heat shock proteins transfer peptides during antigen processing and CTL priming.Immunogenetics, 1994, 39(2):93-98.

[6]Srivastava PK.Immunotherapy for human cancer using heat shock protein-peptide complexes.Curr Oncol Rep, 2005, 7(5):104-108.

[7]Singh-Jasuja H, Toes RE, Spee P, et al.Cross-presentation of glycoprotein 96-associated antigens on major histocompatibility complex class I molecules requires receptor-mediated endocytosis.J Exp Med, 2000, 191(11):1965-1974.

[8]Tamura Y, Peng P, Liu K, et al.Immunotherapy of tumors with autologous tumor-derived heat shock protein preparations.Science,1997, 278(5335):117-120.

[9]Basu S, Srivastava PK.Calreticulin, a peptide-binding chaperone of the endoplasmic reticulum, elicits tumor- and peptide-specific immunity.J Exp Med, 1999, 189(14):797-802.

[10]Elsner L, Muppala V, Gehrmann M, et al.The heat shock protein HSP70 promotes mouse NK cell activity against tumors that express inducible NKG2D ligands.Immunol, 2007, 179(9):5523-5533.

[11]Segal BH, Wang XY, Dennis CG, et al.Heat shock proteins as vaccine adjuvants in infections and cancer.Drug Discov Today, 2006,11(11-12):534-540.

[12]di Pietro A, Tosti G, Ferrucci PF, et al.Heat shock protein peptide complex 96-based vaccines in melanoma: How far we are, how far we can get.Hum Vaccin, 2011, 5(11):727-737.

[13]Eton O, Ross MI, East MJ, et al.Autologous tumor-derived heat-shock protein peptide complex-96 (HSPPC-96) in patients with metastatic melanoma.J Transl Med, 2010, 8:9.

[14]Mazzaferro V, Coppa J, Carrabba MG, et al.Vaccination with autologous tumor-derived heat-shock protein gp96 after liver resection for metastatic colorectal cancer.Clin Cancer Res, 2003, 9(9):3235-3245.

[15]Zhao ZL, Yan L, Cui JD, et al.HSP-peptide complex vaccine in preventing postoperative recurrence of hepatocarcinoma: 32 cases report.Journal of the Fourth Military Medical University, 2005,26(22):2076-2078.(in Chinese)赵子粼, 鄢莉, 崔建东,等.热休克蛋白抗原肽复合物疫苗预防肝癌术后复发32例.第四军医大学学报, 2005, 26(22):2076-2078.

[16]Michaluart P, Abdallah KA, Lima FD, et al.Phase I trial of DNA-hsp65 immunotherapy for advanced squamous cell carcinoma of the head and neck.Cancer Gene Ther, 2008, 15(10):676-684.