抗氧化酶基因转染治疗心血管疾病的研究进展

姜宜成 沈成兴

氧化应激损伤是多种心血管疾病的主要发病机制，运用抗氧化剂或氧自由基清除剂的抗氧化应激作用能够预防和治疗多种心血管疾病。随着基因技术的发展，理论上通过抗氧化剂基因转染高表达抗氧化剂产物来清除氧自由基可能会取得更优越的效果，且这种方法已在多种动物模型中实验成功。我们主要就抗氧化剂基因转染在防治心血管疾病方面的研究进展作一综述。

1 心血管疾病中氧化应激损伤发生机制

心血管疾病已成为危害人类健康的第一杀手。在多种心血管疾病的发病机制中，氧化应激损伤起到了关键性作用，包括心肌病、心力衰竭、心肌梗死、心肌缺血/再灌注损伤、动脉粥样硬化、内皮功能障碍、冠状动脉再狭窄和高血压等［1-5］。药物、炎症、缺血及环境污染，甚至精神压力等因素均可引起机体氧自由基(O2-)和活性氧(reactive oxygen species，ROS)增加，如果这些影响因素过强或持续时间过长，过度消耗了体内的抗氧化剂，机体氧化还原平衡状态将被打破，即发生氧化应激反应，导致组织损伤。其分子机制为:血管内皮细胞产生ROS是通过还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶的非吞噬细胞氧化酶(non-phagocytic cell oxidase，NOX)，解耦合内皮 NO合成酶(nitric oxide syntheses，NOS)和线粒体呼吸作用。ROS可引起脂质过氧化和蛋白质氧化。脂质氧化不但能产生细胞毒性代谢产物，还会导致细胞膜脂质双分子层的破裂。蛋白质氧化导致其巯基或甲硫氨酸残基结构氧化使之构象改变、断裂和交联形成聚合体。蛋白质的氧化还原状态改变在细胞功能上包括基因转录、细胞代谢、离子稳态和信号转导等方面起到重要作用。氧化还原介导的离子通道或离子泵活性的改变导致细胞内Ca2+在缺血/再灌注损伤时显著升高。氧化应激损伤中产生的ROS直接影响钙联蛋白包括理阿诺碱受体(RyR)、SR-Ca2+-ATPase(SERCA)和肌醇-IP3-Ca2+释放通道［6］。另一些心脏兴奋-收缩耦联的关键成分也易于被氧化还原修饰，如 SERCA、L型 Ca2+通道［7］。在心脏缺血/再灌注中ROS产生明显增加导致主要钙调控蛋白活性改变，可能对缺血/再灌注相关的心肌细胞内钙过载起到重要作用。ROS同样能通过氧化还原反应来调节基因的表达，对氧化还原反应敏感的转录因子如核转录因子κB(neuclear factorκB，NF-κB)和激活蛋白 1(activator protein-1，AP-1)等。因此，NF-κB和AP-1代表了对氧化还原敏感的分子靶向，这些转录因子的激活是诱导前炎症基因表达的前提［6］。

2 抗氧化酶在心血管疾病中的作用

抗氧化酶在保持机体精确的氧化还原平衡状态、维持正常的生理功能及应对内源性或外源性氧化应激反应中均起重要的作用。已知的抗氧化酶包括超氧化物歧化酶(super oxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化酶(glutathione peroxidase，GPx)、过氧化氢酶(catalase，CAT)或血红素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)，这些酶可被炎症反应、创伤或其他应激损害诱导产生，其中SOD和HO-1对心血管系统的保护作用研究较多。

SOD是ROS的主要清除剂，它催化O2-发生歧化反应产生过氧化氢(H2O2)和分子氧(O2)。H2O2在CAT、抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)和抗坏血酸谷胱甘肽循环系统的作用下转变为水和氧气。SOD有3种同工酶，分别是Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和EC-SOD，每种表达于独立的细胞亚群，分别在不同区域发挥抗氧化作用。Cu/Zn-SOD分布于所有类型细胞的细胞质和细胞核中，发挥细胞内抗氧化的作用。Mn-SOD主要分布于线粒体内。EC-SOD专一分布及分泌于细胞外的特性使抗氧化保护的作用从细胞内到细胞外均能得到发挥。在EC-SOD基因转染的细胞裂解物或培养物中发现SOD活性增高［8］。细胞内SOD能阻止细胞外O2-跨细胞膜进入细胞内。

CAT是强有力的H2O2清除剂，具有抑制毒性HO-形成的作用。因此，可利用CAT的抗氧化特性来应对缺血导致的氧化应激反应。

GPx是一种广泛存在于线粒体和细胞质内的抗氧化酶，是心脏抗过氧化物损伤最主要的酶，但在缺血条件下因失活而不能发挥作用［9］。

HO-1是胆红素代谢的关键酶，HO-1以NADPH为辅因子来催化胆红素氧化降解为胆绿素、一氧化碳和铁［10］。在胆绿素还原酶催化的胆绿素转化为胆红素的过程中继发性地清除ROS。由于其作用于血管床的特点，有研究显示HO-1高表达可预防心肌缺血性损伤的发生，可通过诱导HO-1的表达或过表达来预防心肌缺血性损伤的发生［11］。

3 心血管疾病的抗氧化酶基因治疗

心血管疾病的抗氧化酶基因治疗原理是将抗氧化酶基因导入心血管系统，并在特定部位表达产物发挥抗氧化应激的作用，从而取得治疗心血管疾病的目的。

HO-1是最具特征的心血管疾病保护基因。HO-1基因转染治疗在一些动物模型中包括自发性高血压大鼠(SHR)［12］、心脏缺血/再灌注损伤［13-15］和颈动脉或股动脉血管球囊成形术均取得了效果。特别指出，在一项以心脏缺血/再灌注损伤大鼠模型进行HO-1基因转移治疗的研究中发现心肌梗死面积减小，与此同时心肌脂质过氧化、凋亡前体蛋白和促炎性细胞因子IL-1β的水平均降低，还伴有抗凋亡蛋白Bcl-2水平的升高，表明HO-1还能通过降低氧化应激及相关炎症和细胞凋亡而增加其心脏保护效果［14］。HO-1基因转移治疗不但能恢复左心室容积和功能，还能减轻心肌纤维化和心室重构。

血管损伤是以炎症反应伴局部修复过程为特征的，这点支持HO-1在血管修复中的保护性作用。以往研究表明，在实验性血管损伤之后新生内膜HO-1诱导衰减［16］。HO-1通过两条以上的非一氧化氮依赖性途径来减轻血管损伤的严重程度［17］。在血管损伤中HO-1直接降低血管收缩和抑制细胞增生。血管表达的HO-1通过鸟苷酸环化酶和环单磷酸鸟苷(cGMP)介导，不依赖一氧化氮直接刺激血管舒张。此外，HO-1通过细胞周期停滞直接抑制血管平滑肌细胞生长。再者，HO-1腺病毒基因转移已经显示出能减少载脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)缺乏动脉粥样硬化小鼠模型的粥样硬化病变［18］。这些研究表明，HO-1可能代表一种体内重要的血管保护介质，它能够降低血管内损伤后的重构反应。

以SOD诱导的基因治疗包括 EC-SOD、Mn-SOD、Cu/Zn-SOD均已经在多种动物模型中实验过。EC-SOD被用来成功地降低了SHR模型的血压［19］，减少球囊扩张血管成形术模型的再狭窄发生［20-21］，减少心脏缺血再灌注模型的梗死面积［22-23］。EC-SOD基因治疗组相对于对照组显著地减少了缺血30min后再灌注的兔心肌梗死模型的梗死面积。最近的一项研究进一步支持和验证了早期研究得出的利用重组腺病毒相关病毒(adeno-associated virus，AAV)转导 ECSOD基因对缺血/再灌注大鼠模型心脏进行预防性保护性治疗，能够延长生存和改善心室功能的结论［23］。EC-SOD基因先于心肌损伤6周转导。EC-SOD基因治疗组通过减小缺血/再灌注损伤24 h后的梗死面积、提高7周后左心室功能及提高长期生存率表现出显著的心肌保护作用。研究提供了预先基因治疗的有利证据和其通过表达分泌型蛋白并以旁分泌方式来保护心脏免于即将受到的损伤而达到心脏保护效果［23］。

Mn-SOD和Cu/Zn-SOD也显示出类似的改善心脏缺血/再灌注损伤的效果［24-25］。已经在心脏缺血/再灌注大鼠模型上通过重组腺病毒表达Mn-SOD和Cu/Zn-SOD分别调节线粒体和细胞质的超氧化水平对这种效果的可能机制进行了研究。Mn-SOD和Cu/Zn-SOD的异位表达保护了缺血/再灌注的心肌，相对于对照组它们能显著地减少心肌梗死面积和心肌细胞凋亡。此外，Mn-SOD和Cu/Zn-SOD的表达推迟了心肌缺血/再灌注损伤后转录因子NF-κB和AP-1的激活。对凋亡前和抗凋亡基因蛋白表达进一步的分析显示，异位SOD表达导致基因表达的改变与抗凋亡的保护性效果一致。研究结果支持无论是线粒体还是细胞质源性的SOD同工酶都能至少部分性地通过改变NF-κB和AP-1的激活来发挥抗缺血/再灌注损伤效果的观点［24］。

抗氧化治疗球囊扩张损伤的成功是令人兴奋的一个新领域。经皮冠状动脉介入治疗(PCI)作为冠状动脉成形术被广泛应用于治疗急性冠脉综合征和慢性缺血性心脏病。之前研究已经证实，球囊扩张成形术能引发急性全身氧化应激反应，局部产生增多和血管SOD活性降低［26-28］，PCI术后再狭窄发生率高。因此，药物洗脱支架广泛用于置入狭窄的冠状动脉，利用药物的缓释来阻止细胞增生，支架可以阻止血管回缩和再狭窄发生。临床试验结果显示治疗原发冠状动脉狭窄，药物洗脱支架的效果优于金属裸支架，发生主要心血管事件的几率降低，药物洗脱支架已被美国食品和药品管理局(FDA)批准用于当前的临床治疗。第一代药物洗脱支架包被西罗莫司或紫杉醇来预防再狭窄。然而，一些研究显示支架置入术后期血栓形成的风险增高［29-30］。鉴于上述问题，一些新型支架系统正在研发。一项研究显示，在球囊扩张血管成形术动物模型上应用EC-SOD基因治疗预防再狭窄的发生取得了有益效果［21］。因此，应用病毒载体直接对氧化应激进行局部治疗也许是一种应对动脉粥样硬化治疗中支架介导的血管损伤的值得研究的策略。

4 前景与展望

随着人口老龄化这个世界性问题日益突出，心血管疾病的发病率、病死率及致残率将逐渐升高，对人类的威胁也愈加严重。鉴于抗氧化酶基因转染方法在临床前的研究中取得了预防和治疗多种心血管疾病的积极效果，因此，一旦证明这种创新的基因转染方法在临床应用上是可行的和安全的，这种方法将使数以百万计的心血管疾病患者从中获益。

［1］Abrescia P，Golino P. Free radicals and antioxidants in cardiovascular diseases.Expert Rev Cardiovasc Ther，2005，3:159-171.

［2］Cantor EJ，Mancini EV，Seth R，et al.Oxidative stress and heart disease:cardiac dysfunction，nutrition，and gene therapy.Curr Hypertens Rep，2003，5:215-220.

［3］Park JG，Oh GT.The role of peroxidases in the pathogenesis of atherosclerosis.BMB Rep，2011，44:497-505.

［4］Higashi Y，Nishioka K，Umemura T，et al.Oxidative stress，endothelial function and angiogenesis induced by cell therapy and gene therapy.Curr Pharm Biotechnol，2006，7:109-116.

［5］Levonen AL，Vähäkangas E，Koponen JK，et al.Antioxidant gene therapy for cardiovascular disease:current status and future perspectives.Circulation，2008，117:2142-2150.

［6］Zima AV，Blatter LA.Redox regulation of cardiac calcium channels and transporters.Cardiovasc Res，2006，71:310-321.

［7］Hu H，Chiamvimonvat N，Yamagishi T，et al.Direct inhibition of expressed cardiac L-type Ca2+channels by S-nitrosothiol nitric oxide donors.Circ Res，1997，81:742-752.

［8］Zhang Y，Gu J，Zhao L，et al.Complete elimination of colorectal tumor xenograft by combined manganese superoxide dismutase with tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand gene virotherapy.Cancer Res，2006，66:4291-4298.

［9］Zhu HL，Stewart AS，Taylor MD，et al.Blocking free radical production via adenoviralgene transfer decreases cardiac ischemia-reperfusion injury.Mol Ther，2000，2:470-475.

［10］Loboda A，Jazwa A， Grochot-Przeczek A， etal. Heme oxygenase-1 and the vascular bed:from molecular mechanisms to therapeutic opportunities.Antioxid Redox Signal，2008，10:1767-1812.

［11］Pachori AS，Melo LG， Zhang L， et al. Chronic recurrent myocardial ischemic injury is significantly attenuated by preemptive adeno-associated virus heme oxygenase-1 gene delivery.J Am Coll Cardiol，2006，47:635-643.

［12］Sabaawy HE，ZhangF， NguyenX， etal. Humanheme oxygenase-1 gene transfer lowers blood pressure and promotes growth in spontaneously hypertensive rats.Hypertension，2001，38:210-215.

［13］Liu X，SimpsonJA， BruntKR， etal. Preemptiveheme oxygenase-1 gene delivery reveals reduced mortality and preservation of left ventricular function 1 yr after acute myocardial infarction.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，293:H48-59.

［14］Melo LG，Agrawal R，Zhang L，et al.Gene therapy strategy for long-term myocardial protection using adeno-associated virusmediated delivery of heme oxygenase gene.Circulation，2002，105:602-607.

［15］Liu X，Pachori AS，Ward CA，et al.Heme oxygenase-1(HO-1)inhibits postmyocardial infarct remodeling and restores ventricular function.FASEB J，2006，20:207-216 .

［16］Tulis DA，Durante W，Liu X，et al.Adenovirus-mediated heme oxygenase-1 gene delivery inhibits injury-induced vascular neointima formation.Circulation，2001，104:2710-2715.

［17］Hyvelin JM，Maurel B，Uzbekov R，et al.Hemin prevents instent stenosis in rat and rabbit models by inducing hemeoxygenase-1.J Vasc Surg，2010，51:417-428.

［18］Juan SH，Lee TS，Tseng KW，et al.Adenovirus-mediated heme oxygenase-1 gene transfer inhibits the development of atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice.Circulation，2001，104:1519-1525.

［19］Chu Y，Iida S，Lund DD，et al.Gene transfer of extracellular superoxide dismutase reduces arterial pressure in spontaneously hypertensive rats:role of heparin-binding domain.Circ Res，2003，92:461-468.

［20］Laukkanen MO，Kivelä A，Rissanen T， et al.Adenovirusmediated extracellular superoxide dismutase gene therapy reduces neointima formation in balloon-denuded rabbit aorta.Circulation，2002，106:1999-2003.

［21］Bräsen JH，Leppänen O， Inkala M， etal. Extracellular superoxide dismutase accelerates endothelial recovery and inhibits in-stent restenosis in stented atherosclerotic Watanabe heritable hyperlipidemic rabbit aorta.J Am Coll Cardiol，2007，50:2249-2253.

［22］Seshadri G，Sy JC，Brown M，et al.The delivery of superoxide dismutase encapsulated in polyketalmicroparticles to rat myocardium and protection from myocardial ischemia-reperfusion injury.Biomaterials，2010，31:1372-1379.

［23］Agrawal RS，Muangman S，Layne MD，et al.Pre-emptive gene therapy using recombinant adeno-associated virus delivery of extracellular superoxide dismutase protects heart against ischemic reperfusion injury，improves ventricular function and prolongs survival.Gene Ther，2004，11:962-969.

［24］Yang J，Marden JJ，Fan C，et al.Genetic redox preconditioning differentially modulates AP-1 and NF kappa B responses following cardiac ischemia/reperfusion injury and protects against necrosis and apoptosis.Mol Ther，2003，7:341-353.

［25］Woo YJ，ZhangJC， VijayasarathyC， etal. Recombinant adenovirus-mediated cardiac gene transfer of superoxide dismutase and catalase attenuates postischemic contractile dysfunction.Circulation，1998，98(19 Suppl):II255-260.

［26］Berg K，Wiseth R，Bjerve K， et al. Oxidative stress and myocardial damage during elective percutaneous coronary interventions and coronary angiography.A comparison of bloodborne isoprostane and troponin release.Free Radic Res，2004，38:517-525.

［27］Tsimikas S，Lau HK，Han KR，et al.Percutaneous coronary intervention results in acute increases in oxidized phospholipids and lipoprotein(a):short-term and long-term immunologic responses to oxidized low-density lipoprotein.Circulation，2004，109:3164-3170.

［28］Leite PF，Danilovic A，Moriel P，et al.Sustained decrease in superoxide dismutase activity underlies constrictive remodeling after balloon injury in rabbits.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2003，23:2197-2202.

［29］Daemen J，Wenaweser P，Tsuchida K，et al.Early and late coronary stent thrombosis of sirolimus-eluting and paclitaxeleluting stents in routine clinical practice:data from a large twoinstitutional cohort study.Lancet，2007，369:667-678.

［30］Pfisterer ME.Late stentthrombosisafterdrug-eluting stent implantation for acute myocardial infarction:a new red flag is raised.Circulation，2008，118:1117-1119.