亚麻外源DNA导入的技术与实践

康庆华

(黑龙江省农业科学院经济作物研究所，哈尔滨 150086)

1 外源DNA导入的理论

外源DNA导入在我国已有近30多年研究历史，自20世纪70年代，我国学者周光宇女士首先提出植物远缘杂交存在着DNA片段杂交的假说［1－2］以来，开展了棉花授粉后通过花粉管道导入外源DNA试验，将海岛棉DNA导入陆地棉引起了性状变异，获得了抗枯萎病的转基因植株，经过同位素标记验证了在棉花授粉后24小时将3H－DNA注入棉花子房，4小时后切片经3H－DNA放射自显影清楚看到花粉管通道充满了标记DNA，外源DNA从珠孔进入珠心达到胚囊。并用分子杂交验证了基因的转移及遗传［3］。

利用开花植物授粉以后形成的花粉管通道，直接导入外源DNA来转化尚不具有正常细胞壁的合子、卵或早期胚细胞，进而实现某些目的基因的转移技术［4］。其理论基础是作物受精过程中，精核的染色质在卵核内分散的时间长达几小时至十几小时，而融合后的合子还要经过10～20小时的静止期［5－7］，这时不具备正常的细胞壁，有利于外源DNA的进入，从而实现某些目的基因的转移。任何生物的DNA均由4种基本核苷酸连接而成，有可能在顺序上出现程度不同的相同的排列有利于整合。DNA结构复杂，包括结构基因、调控基因，重复序列DNA。外源DNA片段进入受体，整合是随机的，可能整合到结构基因中，也可能通过调控基因，以调控方式发挥作用。

20世纪90年代这一技术在国内得到了广泛的应用并取得了巨大成就。在棉花、水稻、小麦、蕃茄、玉米、花生、大豆、大麦、黄瓜等作物上都获得了变异后代。

段晓岚等将大米草DNA导入水稻，使其蛋白质含量提高了3．75%［8］。赖来展等将黑糯品种DNA导入白米品种，育成了高产、高蛋白的黑米新品系－黑优粘96［9］，阎新甫等将抗白粉病二棱大麦DNA通过花粉管通道法直接导入感病小麦品种花76，获得5个稳定的抗白粉病株系［10］。雷勃钧等利用该技术育成了早熟、高蛋白大豆新品种黑生101。岳绍先等将龙葵抗阿特拉津的基因导入大豆［11］，育成了抗阿特拉津的大豆新品种，并于1998年获得农业部科技进步三等奖。祈永红等将紫玉米DNA导入玉米自交系抗甸11，获得了具有供体性状的优良自交系［12］。

综上所述，采用外源DNA导入技术不仅可以在品种间进行性状的转移［13］，而且还可以在不同的种、属、科间进行性状的转移［14－16］，为近缘或远缘野生资源的利用开辟了新途径。该项技术不仅可以改良作物的品质及抗逆性，而且可以改变株高、粒重、粒色、叶色等各种性状［17］达到杂交育种难以实现的效果，同时对提高抗病、抗虫、抗除草剂能力，提高产量都有重要作用。

利用花粉管通道导入外源DNA技术，不仅在多种作物上获得了丰富的变异材料，而且采用不同方法对该技术进行了检验。主要采用的方法有:植株性状鉴定［17－18］、同工酶鉴定［19－20］、RAPD分子验证［21］、Southern 杂交［22］等技术。

我所从亚麻的DNA的提取、亚麻的授粉时间、外源DNA导入的时间及方法、后代的变异及其鉴定等进行了研究，旨在提供一整套切实可行易于操作、效果显著的亚麻外源DNA花粉管通道导入技术，对亚麻育种的理论与实践起到一定的指导作用。

2 亚麻外源DNA导入技术

2.1 亚麻植株体DNA提取方法

DNA的提取和纯化是为了获得一定数量、一定纯度的DNA，是DNA导入在植物育种上应用的第一步，只有提取到一定数量的合格的DNA才能进行DNA导入试验。亚麻种子及植株都含有大量的果胶，果胶同DNA一样在碱性条件下溶于水而不溶于乙醇。利用多数作物采用的氯仿－异戊醇－核糖核酸酶法提取亚麻根尖的DNA效果不十分理想，特别是利用亚麻植株提取DNA时效果更差，但由于亚麻种子小，尤其是野生亚麻发芽十分困难，必须利用植株体提取DNA。为此进行了亚麻植株DNA提取技术研究。对饱和酚法、氯仿－异戊醇－核糖核酸酶法、CTAB法、蔗糖研磨缓冲液提取法、改良高盐－低pH法进行了研究。结果改良高盐－低pH法为亚麻大量DNA提取的最适宜方法。

即在亚麻快速生长期，取植株体上部10～15cm的幼嫩部分，用自来水冲洗2～3次，再用蒸馏水冲洗2次后剪成1cm的碎段，取样20克，在液氮冷冻条件下研磨成粉沫，加入等体积或4倍体积的提取缓冲液，65℃恒温条件下，保持30～40分钟，不断振荡，离心取上相，加入1/3～2/3体积的5M的醋酸钾，0℃保持30分钟，离心取上相加入0．6体积的冷异丙醇混匀后冷冻20分钟离心，收集沉淀溶于0．1×SSC中。利用琼脂糖凝胶电泳法对提取的DNA进行了检测，供试样品的DNA片段长度接近50kb，其长度符合分子育种外源DNA导入的要求，同时该方法具有高效、省时、无毒、简便、经济等特点。是目前进行亚麻植株体DNA提取的比较理想的方法［23］。

2.2 亚麻授粉时间及授粉后子房内部结构

由于不同作物的花器构造，大小及开花授粉时间不同，利用花粉管通道导入技术进行外源DNA导入的时间及方法也就不同。亚麻从授粉到受精需2．5～3小时［24］，受精后经过24～30小时卵细胞开始分裂［24－25］，如此长时间的合子静止期足以等待外源DNA的到达，所以问题的关键是在子房内部是否有可供DNA进入的通道，于是进行了授粉后子房内部结构的观察。

利用不同时间现蕾的亚麻花朵去雄套袋的方法进行了亚麻自花授粉时间的观察看出:8:00时的子房内部未发现有明显的通道，10:00的可见到花粉通道已达到子房的底部，从12时以后通道逐渐变大，14时以后从子房顶部到基部可见到明显的通道，这给外源DNA的进入创造了方便的条件。

2.3 外源DNA导入的时间及方法

外源DNA导入有许多方法，具体作物应根据其花器结构、大小、形状的不同而有所区别，同时应考虑到授粉、受精时间的影响及DNA导入时的温、湿度变化。

亚麻的子房较大，每个蒴果具有5个子房室10个胚囊。子房上位并且包在萼片内，花柱切割以后，滴DNA十分方便，因此选择了花粉管通道法。具体的处理方法是:1、花柱中部切割滴注法;2、花柱基部切割滴注法;3、子房注射法。结果是，花柱基部切割滴注法成果率为81．8%，花柱中部切割滴注法成果率为92．1%，子房注射法成果率为53．8%。前两种方法成果率均较高，但花柱基部切割缩短了切口到胚囊的距离，更有利于外源DNA通过花粉管通道进入胚囊。

根据外源DNA导入方法的试验结果，采用花柱基部切割滴注法进行了亚麻外源DNA导入时间的研究。对外源DNA导入后代的筛选，可以获得理想的变异材料。但有效的导入方法及适宜的导入时期对获得更多的变异具有重要的作用。因为亚麻授粉时间在5点40分才能少量授粉，而授粉到受精还需要3h左右。8点30分可能还未达到授精阶段，所以不能成活;10点30分至13点30分，成果率在50%～70%之间;16点30分以后的成果率在80%以上。可见，亚麻外源导入的成果率在9点钟以后随着时间的推移而逐步提高［26］。

2.4 外源DNA导入后代植株性状的变化

对外源DNA导入后代各世代的观察，发现其后代中具有广泛的变异。花色、株高、种皮颜色、抗倒伏性等发生了明显的变化。这四种变异为变异频率较少，而变异极为显著的性状。还有些性状需经室内考种或测试才能观察到的变化，而且这些性状是与育种目标极为相关的性状。1995年利用D94001、D94002等6个DNA导入后代，对D1代的株高、工艺长度、麻率的变化进行了研究，株高和工艺长度与受体相比均有不同程度的降低，株高降低的幅度在6．1～20．1cm之间，工艺长度降低的幅度在2．3～25．2cm之间，D94001、D94002和D94006的株高和工艺长度与各自的受体有明显的差异，麻率也有明显的变化。DNA导入后代不仅可以发生变异而且可以稳定遗传。性状表现看出:11点30分DNA导入的后代有明显的变化，可以认为11点30分左右是DNA导入的适宜时间，尤以花柱基部切割法滴注效果最佳。

亚麻外源DNA导入后代同样在多个性状上发生了变异，花色、粒色、株高、工艺长度、麻率、抗倒伏等性状都有变异，而且株高、工艺长度、麻率、抗倒伏等性状的变异均趋向于供体。而麻率及抗倒伏性的提高正是目前亚麻育种所要解决的关键问题，这也说明外源总DNA导入对于育种中的实际问题的解决具有重要意义。

通过形态学观察，遗传学分析，发现亚麻外源DNA导入后代在株高、工艺长度、麻率、抗倒伏性、花色、种皮色等性状有变异，一般D3～D4代可稳定遗传，利用该技术进行育种，可缩短育种年限，加速育种进程［27］。

2.5 外源DNA导入后代不同世代的遗传力分析

遗传力是指遗传引起的变异量占变异总量的百分比，并非遗传传递力［28］，但通过遗传力的研究，确实能有效的预测后代的表现，因此对外源DNA导入后代的遗传力进行了研究。结果是不同性状各世代的遗传力差异不大，但随着世代的增加其遗传力有增大的趋势，各性状均趋于稳定遗传。株高对亚麻原茎产量的直接影响效应最大［29］，遗传力的大小可作为依表型株选时确定选择宽度的指标［30］。从遗传力分析结果可见，株高、工艺长度、出麻率均具有较高的遗传力，所以对DNA导入后代在早世代对株高、工艺长度、麻率等性状进行严格选择，对于提高亚麻的原茎及纤维产量具有重要的意义。通过过氧化物酶同工酶酶谱分析，DNA导入后代与其受体的酶谱差异明显，主要表现为酶谱带数的不同和谱带染色深浅的差异。由此表明外源DNA片段(或基因)已整合到受体基因组中，并得到表达［31］。

3 外源DNA导入实践

亚麻外源DNA导入技术已经发展成为一种成熟的育种技术。采用该技术育成了一批亚麻优良品种及品系。1993年以高纤、抗倒、早熟的法国亚麻品种FANY为供体，以高产品种黑亚l0号为受体进行DNA导入，组合号为D93007。按照育种目标进行了定向培育选择，于l997年D4代筛选出了亚麻新品系D93007－15－8。

1998～2000年在所内进行了鉴定试验，经过三年鉴定，该品系表现出了优质、高产、抗倒伏的特性。于2001年参加全省区域试验(编号为2001－1)。2002年同时进行了区域试验及生产试验。2003年3月经黑龙江省农作物品种审定委员会审查通过同意注册，命名为黑亚14号［32］。黑亚l4号综合了亲本品种的优异遗传基因，具有高产、优质、抗倒伏、抗病等优点，2003～2005年在黑龙江省累计推广面积达到1O余万hm2，增产亚麻原茎7万t。增加经济效益2．1亿元。黑亚l4号不仅适宜于黑龙江省广大地区种植，还推广到吉林、内蒙、新疆、云南等十几个省(区)，示范效果显著［33］。

2006年育成的黑亚16号是以高纤、抗病、抗倒、早熟的俄罗斯亚麻品种俄－5为供体，以我所育成的优质、高纤、抗旱品种黑亚4号为受体进行DNA导入，于2000年D4代决选出了亚麻新品系D96021－1。经两年鉴定试验和两年区域试验均表现出高纤、优质、抗病、抗倒等优点。2005年生产试验原茎产量5842．3kg/hm2，比对照增产 11．8%;长麻产量986．6kg/hm2，比对照增产 18．1%;全麻1469．7kg/hm2，比对照增产 18．6% 种子产量 405．9kg/hm2，比对照增产 15．8%;长麻率 20．6%，比对照高0．9 个百分点;全麻率30．8%，比对照高1．3 个百分点［34］。

2007年育成的黑亚17号是以法国品种Ariane为供体、品系81－8－6－3为受体的导入后代选育而成的纤维亚麻新品种。原茎、长麻，全麻、种子产量分别达到5595．9、873．1，l338．7和594．7 kg/hm2。分别比对照增产 9．O%、16．5%、11．7%和 16．2%。长麻率 19．5%，比对照高 1．7 个百分点;全麻率29．9%，比对照高1．1个百分点。2007年于3月通过黑龙江省农作物品种审定委员会登记推广［35］。

此外，目前还育成了一些品系，如D2000004－7－6、D2000004－30－3、D97009－2等，原茎、长麻，全麻、种子产量都比对照(黑亚11号)增产10%以上，长麻率比对照高1．5个百分点以上;全麻率都在30．0%以上。目前，这些品系还有待进一步鉴定推广应用。

由此可见，应用亚麻外源DNA导入技术选育亚麻新品种是继系统选育、杂交育种、诱变育种之后又一育种新途径。它具有速度快、效果好等突出优点，丰富了亚麻育种的理论与技术，对我国的亚麻育种、生产、教学等都具有重要意义。

［1］周光宇．也谈玉米稻［J］．遗传与育种，1977(5):24 －25．

［2］周光宇．远缘杂交的分子基础－DNA片断杂交假设的一个论证［J］．遗传学报，1979，6(4):405－413．

［3］黄骏麟．外源抗枯萎病棉DNA导入感病棉的抗性转移［J］．中国农业科 学，1986，19(3):32－36．

［4］雷勃钧．外源DNA直接导入技术在育种上的应用［J］．黑龙江农业科学，1993(2):41－44．

［5］申家恒．大豆受精作用的研究［J］．植物学报，1983，25(3):213－217．

［6］申家恒，王谱，李慧荣，等．春小麦受精过程及其各阶段持续时间的研究［J］．作物学报，1983，9(2):79－82．

［7］成仿云，金芝兰．糜子双受精过程的细胞学观察［J］．植物学报，1993，35(2):96－101．

［8］段晓岚，陈善葆．外源DNA导入水稻引起性状变异［J］．中国农业学，1985，18(3):6－9．

［9］赖来展．黑米稻性状变异［J］．福建农学院学报，1987，(3):175－181．

［10］阎新甫，刘文轩，王胜军，等．大麦DNA导入小麦抗白粉病变异的研究［J］．遗传，1994，16(1):26－30．

［11］岳绍先，傅骏骅，李连城，等．抗Atrazine基因导入黑龙江大豆品种及其表达和遗传［J］．中国农业科学，1996，29(1):78－83．

［12］祁永红，李春秋，陈喜昌，等．外源DNA导入玉米自交系获得变异新品系［J］．黑龙江农业科学，1998，(5):1－4．

［13］雷勃钧，卢翠华，钱华，等．导入外源DNA获得大豆早熟新品系［J］．作物学报，1996，22(2):174－177．

［14］阎新甫，刘文轩，林秋平．外源DNA导入小麦后代变异株系的酯酶同工酶分析［J］．华北农学报，1994，9(1):39－43．

［15］阎洪奎，王丹恕，肖永瑚，等．经水稻花粉管导入外源DNA的放射自显影研究［J］．吉林农业科学，1998(1):38－40．

［16］朱新产，朱庆麟，廖祥儒．导入外源DNA小麦蛋白质变异性的研究［J］．华北农学报，1998，13(1):36－39．

［17］刘根齐，张孔恬，林世兰，等．外源DNA直接导入小麦及其在育种上的应用［J］．遗传学报，1994，21(6):463－467．

［18］卢翠华、雷勃钧、尹光初等．外源DNA导入栽培大豆其后代过氧化物酶同工酶谱分析 ［J］．中国油料，1991(3):35－36．

［19］王黎明，阴秀卿．高粱导入外源DNA的过氧化物酶及酯酶同工酶谱分析［J］．黑龙江农业科学，1994(3):17－20．

［20］刘德璞，袁鹰，庄炳昌．外源DNA导入大豆变异后代的SOD同工酶分析［J］．大豆科学，1991，10(3):194－198．

［21］李希臣，雷勃钧，卢翠华，等．早熟大豆外源DNA导入的RAPD分子验证［J］．大豆科学，1994，13(2):152－156．

［22］陈春洪，王志坚，孙玲，等．用花粉管通道将外源DNA导入水稻的研究［J］．广东农业科学，1998(4):2－3．

［23］王玉富，周思君，刘燕，等．亚麻总DNA快速提取方法的研究［J］．中国麻作，l997，19(1):19－21．

［24］李宗道．麻作的理论与技术［M］．上海科学技术出版社，1980，288．

［25］卫德杯．译自 亚麻栽培 (前苏联)［M］．黑龙江省亚麻原料工业研究，1975，40．

［26］刘燕，王玉富，关凤芝，等．亚麻外源DNA导入的适宜时期与方法的研究［J］．中国麻作，1997，19(3):13－15．

［27］王玉富，刘燕，杨学，等．亚麻外源DNA导入后代的遗传与变异研究［J］．中国麻作1999，21，(3):7－11．

［28］刘世强．实用遗传学［M］．辽宁科学技术出版社，1986，211．

［29］王玉富，颜忠峰，路颖，等．亚麻主要数量性状的遗传研究［J］．中国麻作，1991(1):4－6．

［30］孙家曾．黄麻主要经济性状遗传力相关性的研究［J］．中国农业科学，1981(3):25－32．

［31］王玉富，刘燕、乔广军等．亚麻外源D N A导入后代的过氧化物酶同工酶分析［J］．中国麻作，1996，18(3):6－8．

［32］王玉富，刘燕，康庆华，等．纤维亚麻新品种黑亚14号选育报告［J］．中国麻业，2003，25(3):112－113，142．

［33］徐丽珍．亚麻新品种黑亚14号的应用效果及评价［J］．中国麻业，2006，28(1):21－23．

［34］关凤芝，路颖，宋宪友，等．黑亚16号亚麻新品种的选育 ［J］．中国麻业科学，2006，28(6):289－290，314．

［35］关凤芝，吴广文，宋宪友，等．纤维亚麻新品种黑亚17的选育［J］．黑龙江农业科学，2009(1):152－153．