Afatinib(阿法替尼)治疗非小细胞肺癌的研究进展

王允芬 宋 勇

一、HER 家族

酪氨酸激酶受体EGFR家族，也被称为人表皮生长因子受体(human epidermal growth factor receptor，HER)或者 ErbB 家族，它由 HER1/ErbB1 即 EGFR，HER2/ErbB2，HER3/ErbB3，HER4/ErbB4组成。EGFR是一种细胞膜表面的糖蛋白受体，其结构分为:胞外配体结合区，跨膜结构域和具有酪氨酸激酶活性的胞内区域。当配体(EGF、TGF-α等)与受体胞外结合后EGFR被活化，EGFR单体之间或EGFR与ErbB家族其他成员之间形成同源或异源二聚体。随后，EGFR胞内的酪氨酸激酶区域被激活，发生酪氨酸的自身磷酸化，从而引起下游信号通路如PI3K/AKt和Ras/Raf/MAP激酶通路等的活化［7］。这些与癌细胞存活和生存有关的信号转导通路的活化，最终会导致癌细胞异常增生和转移。

EGFR在激酶部分包含了激活突变位点(外显子18－21)，这些突变位点最初对吉非替尼治疗有明显的反应。EGFR包含了19外显子的缺失突变(del19)和21外显子的替换突变(L858R)，或者一些像G719S、L861Q等不常见的突变。这些突变能够在缺乏配体的状态下增强激酶的结构活性，进而能够打破激酶激活和非激活的平衡状态，使平衡向激活状态倾斜［8］。激活突变作用于酪氨酸激酶受体(TKIs)类似于超敏反应，因为它只是降低了ATP与EGFR的结合亲和力，进而增强了阻滞剂的竞争结合力，所以其作用不能被单克隆抗体阻断。

在HER家族信号转导的过程中，受体二聚体化是重要的一步。胞内的酪氨酸残基的磷酸转移导致调节细胞进程如细胞增殖等的下游信号的活化。对HER家族信号反应的持续时间取决于特定的HER二聚体的形态［9］。例如，异源二聚体受体相对于同源二聚体来说对细胞有丝分裂和转化有更强的作用。

鉴于EGFR在非小细胞肺癌中的重要性，目前已经成功研发了几种针对EGFR特定靶点的药物，包括结合胞内酪氨酸激酶的TKIs(如厄洛替尼、吉非替尼)和直接作用于胞外受体的单克隆抗体如西妥昔单抗等。

吉非替尼、厄洛替尼是口服的EGFR TKIs。吉非替尼(易瑞沙)是第一个被FDA(美国食品药品管理局)批准用于NSCLC患者二线或三线治疗的EGFR靶向药物［10］。该药被FDA通过很大程度上是基于Ⅰ/Ⅱ期的IDEAL1和IDEAL2实验数据结果［11-12］。然而，在用来评估吉非替尼作用的Ⅲ期ISEL实验中，吉非替尼与安慰剂相比，并没有表现出在生存期OS(overall survival)方面的获益［13］。同样Ⅲ期的INTERST实验证实在既往接受过治疗的患者中，与多西他赛相比，吉非替尼耐受性较好且在OS方面也没有明显劣势［14］。厄洛替尼(特罗凯)是继吉非替尼之后再次被FDA批准通过的用于治疗NSCLC的EGFR受体阻滞剂［15］。在既往接受厄洛替尼治疗的NSCLC中，该药已被证实了有明显的生存获益。在BR．21实验中，731个患者以2∶1的比例被随机分配到了厄洛替尼组和安慰剂组，其中厄洛替尼剂量为150 mg/d［16］。最终与安慰剂相比，厄洛替尼有明显的OS改善(7．9 月 VS 3．7 月，hazard ratio HR，0．7;P＜0．001)。在Ⅲ期的 SATURN 实验中，与安慰剂相比，厄洛替尼明显延长了PFS(progression-free survival，HR 0．71)，在一线化疗结束后的二线维持治疗中，厄洛替尼在OS方面较安慰剂也有明显的改善(HR，0．81)［17］。在EGFR激活突变的患者中，这种优势更加明显。

在NSCLC中，尽管EGFR TKIs被证实有明显的临床获益，但在早期的研究中证实只有不到10%的未经选择的患者对EGFR TKIs有反应［18］。对EGFR TKIs的回顾性分析证实了治疗的客观反应率与特定的临床特征相关，包括亚裔、女性、腺癌、不吸烟史［19］。然而，统计学和临床实际结果之间的预期价值仍有少许差异。

二、EGFR靶向治疗的耐药机制

一小部分EGFR激活突变的NSCLC患者对EGFR TKIs的首次治疗表现出无明显应答，这被称为天然耐药。它与单个基因的肿瘤成瘾之间可能并无关系，而只是与其他繁冗的肿瘤基因如KRas等的激活有关［20］。另外，活化的细胞表面第二受体如成纤维细胞生长因子受体 (fibroblast growth factor receptor，FGF-R)等可能调节这种天然耐药［21］。所有最初对EGFR TKIs有效的肺癌患者随着治疗时间的延长最终都会发展为治疗耐药、疾病进展等，这称为获得性耐药。如T790M的一个点突变造成近50%的肿瘤患者获得性耐药［22］。据推测在受体中，构象改变能诱导非共价结合的可逆性，引起EGFR抑制剂如厄洛替尼、吉非替尼从胞内的酪氨酸激酶部分的ATP结合位点被替换［23］。这些结构的改变在突变受体内可能导致大量的乙硫磷侧链产生，或者使得ATP的结合力增强，进而导致获得性耐药［24］。获得性耐药的其他机制还包括HER2基因的“激酶转换”和IGF-1R(insulin growth factor-1 receptor，胰岛素样生长因子受体)［25］、MET 基因等的扩增［26］。

兴趣是指人积极探究某种事物及爱好某种活动的心理倾向，是人认识需要的情绪表现，反应了人对客观事物的选择性态度。培养和激发学琴的兴趣，诱发其学习的内部动力，是促进学好钢琴的重要保证。

有以下几种措施可以克服EGFR TKIs的耐药机制:①找出新的不与受体ATP结合位点竞争性结合的EGFR TKIs;②在受体中发明新的能够与受体ATP结合位点结合、不被替换或者构象稳定的不可逆性的EGFR-TKIs;③联合能够阻挡EGFR配体结合位点的药物(如抗EGFR抗体的西妥昔单抗)，阻挡受体的激酶活性(小分子的阻滞剂);④寻找EGFR和其二聚体成分-HER2，IGF-1R，FGFR等的双重阻断剂;⑤寻找主要在获得性耐药旁路信号通路中的阻滞剂。在上述的策略中，后两种措施已在临床中深入研究。

大量针对HER家族成员的不可逆双重受体阻滞剂已经问世，包括BIBW 2992，PF299804等。但BIBW 2992(阿法替尼)和PF299804目前尚在开展Ⅲ期临床验证实验。

三、阿法替尼(BIBW 2992，afatinib)的抗肿瘤作用

阿法替尼(BIBW 2992，afatinib)为新型口服制剂，苯胺奎那唑啉化合物，是一种不可逆的EGFR-HER2双重酪氨酸激酶受体抑制剂。它能不可逆的与EGFR-HER2酪氨酸激酶结合，抑制其酪氨酸激酶活性，进而阻断EGFR-HER2介导的肿瘤细胞信号传导，抑制肿瘤细胞的增殖与转移，促进肿瘤细胞的凋亡。它与EGFR的Cys 773和HER2的Cys 805共价结合，在对厄洛替尼和吉非替尼耐药的突变细胞中仍然有作用，该制剂由勃林格殷格翰公司研发［27］。

1．临床前期试验:在临床前期试验中，阿法替尼被证实在一系列不同的肿瘤细胞系内有抗肿瘤作用。在野生型EGFR的人上皮细胞癌A431细胞系及HER2的乳腺癌BT474细胞系和胃癌NCI N87细胞系内均表达。阿法替尼在受体磷酰化方面有明确作用，这也转化为其在抗肿瘤中的作用，且已经在A431细胞系的异种移植以及胃癌NCI N87细胞系上得到了验证。在双重EGFR突变(L858R-T790M)的NCIH 1975细胞系中，阿法替尼控制住了肿瘤，并验证了其对第一代EGFR TKIs(厄洛替尼、吉非替尼)耐药肿瘤的有效性［27］。

Li等［28］对双重EGFR靶点的生物学特性在特殊EGFR突变基因驱动的经四环素介导的双重转基因肺腺癌小鼠模型中作了深入研究。在这个模型中，与预期结果一致的是，厄洛替尼对潜在L858R突变有效，T790突变则不起作用。阿法替尼和针对EGFR胞外部分靶点的西妥昔单抗，则对T790突变或双重L858R-T790M突变的肿瘤具有抑制作用，但是治疗结果仅仅是SD(stable disease)或者PR．(partial response)。然而，在双重突变的肿瘤模型中，两药联合却能够使治疗结果达到CR(complete response)。显而易见，这两者之间存在着某种协同作用，但目前该协同作用的机制仍不明了，仍需研究。推测可能是当阿法替尼导致EGFR的TK部分去磷酸化时，西妥昔单抗则导致EGFR的全部下调。同样有可能，阿法替尼通过西妥昔单抗提高了受体的细胞内化作用，并且增强了抗体依赖性细胞调节的细胞毒性。

2．Ⅰ期临床试验

(1)单药阿法替尼在晚期实体瘤中的Ⅰ期临床试验:基于期望能够改善临床前期的结果，增加理论支持的力度，目前研究人员已经开展了4个临床I期试验来评估阿法替尼在肿瘤中不同方面的作用。所有这些实验都采用经典的3组+3组剂量按比例上升的设计。最大耐受剂量(maximum tolerated dose，MTD)就是最高剂量，即6组患者中有没有或者仅有1组患者能够耐受剂量限制性毒性(dose-limiting toxicity，DLT)。因此，MTD是一个能够在以后的Ⅱ期实验中深入研究的最佳剂量。DLT定义为发生在治疗第一个周期(28 d)间的3、4级非血液系统毒性，或者4级血液系统毒性。然而，在最佳支持治疗状态下发生的3级腹泻、恶心、呕吐，也归类为为DLT。另外，2级毒性持续超过7 d，或者左心室射血分数(LEVF)的减低、肾功能2级或更差同样被认为是DLT。

Eskens等开展了一项2周用药/2周不用药的实验［29］。38个患者被分配至7个实验组，实验剂量从10 mg/d到100 mg/d不等。DLT定义为大于70 mg，包括转氨酶水平、疲乏、腹泻和皮疹等，另外还包括鼻出血(N=20)和无症状性LVEF减低(N=2)，因此MTD是70 mg。验证阿法替尼抗肿瘤作用最直接的证据是包括NSCLC和肠癌在内的7个实验组持续4个周期以上的疾病SD。

药代学分析表明阿法替尼平均半衰期大约为28～43 h，治疗8 d后达稳定状态。药代学参数表明患者体内最高浓度有适量的差异，但组织分布是相似的［30］。目前该药在人体的生物利用度如何还不得而知。

Lewis等［31］开展了另外一项阿法替尼3周用药/1周停药I期试验。该实验纳入43个患者，分为5个剂量组，剂量分别为10～65 mg/d。65 mg实验组中的6个患者有3个出现DLT，分别为皮疹和黏膜炎。在扩大样本的cohort分析中，55 mg组的20个患者出现的DLT，具体为皮疹、腹泻和黏膜炎。因此该实验将40 mg组定为MTD组。尽管治疗没有客观反应，但有4个患者维持SD超过6个月。

Yap等［32］开展了一项阿法替尼每日持续用药的实验。53个患者被纳入该研究。同时观察了食物对阿法替尼药代学的影响。实验分为10～50 mg不等的5个组，13个患者为50 mg组，DLT3级的表现为皮疹。因此MTD被定义为50mg/d。其中一个患者出现了LVEF的降低，经过研究，被认为是胸腔和心包积液的副作用。该实验也有力的证明了阿法替尼的抗肿瘤作用。根据RECIST标准，有3个非小细胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)患者达到确定的PR，在这3个患者中，有2个是EGFR突变的。另外，2个肺癌和食管癌的患者，分别达到不确定的PR。另外7个包括肠癌、乳腺癌、甲状腺癌等的患者达到了超过6个月的疾病SD。

Yap等［32］的药代学数据表明，阿法替尼的半衰期是21～27 h，1周后达到血药浓度稳定。药代学参数受剂量比例的影响。该实验表明高脂食物的摄取减少了药物的吸收，这表明阿法替尼应该被快速服用。该研究没有明确的证据表明阿法替尼与体重和体表面积有关，而体重和体表面积决定了药物一个复杂的口服剂量。

另外，Augs等［33］报道了一个阿法替尼每日连续用药的实验结果。该实验纳入了22个患者。分为从10～60 mg不等的4个剂量组，在60 mg实验组的3个患者中有2个出现了腹泻，腹泻是最基本的DLT。因此，40 mg被定义为MTD，11个患者中只有1个出现了DLT。

(2)阿法替尼联合化疗治疗晚期实体瘤的Ⅰ期实验:阿法替尼联合不同的化疗方案，包括顺铂/紫杉醇和顺铂/5-氟尿嘧啶［34］，每周一次紫杉醇［35］和每3周一次的多西他赛［36］方案治疗肺癌的实验也如有较多报道。在这些研究中，只取得了有限的实验结果，但是可以观察到在联合用药后阿法替尼的抗肿瘤效果明显提高。每日阿法替尼40 mg口服与紫杉醇每周一次的联合应用预测是接下来Ⅱ期实验的剂量，该剂量带有轻度的可调节、耐受的副反应。其中8例患者在治疗4个周期后继续治疗。Awada等［29］的研究结果表明，在多西他赛(75 mg/m2静滴d1)联合阿法替尼(口服2～4/d)21 d一个周期的实验中，多西他赛和阿法替尼并没有出现相反的药代学结果。该实验纳入40例患者，剂量为10～160 mg不等，MTD是90 mg，DLT包括一个患者4级中性粒细胞减少，及阿法替尼120 mg剂量组患者的恶心、呕吐和腹泻。该实验表明两药联用的毒性与单药阿法替尼类似，最常见的是疲劳(63%)，腹泻(58%)，厌食和口腔炎(53%)，皮疹(43%)，神经炎(30%)。包括乳腺癌、食管癌、胸腺瘤等在内的5例患者治疗后有反应，其中1例患者出现疾病CR。有趣的是，其中2例对治疗有反应的患者是预先经过紫杉烷暴露的。另外10例患者出现了超过6个周期的SD，有4例患者持续了至少9个周期的治疗。这些结果证实，阿法替尼联合化疗的临床效果较好，且容易耐受。这为下一步大规模的研究阿法替尼联合化疗或紫杉烷类提供了潜在的依据。

3．阿法替尼NSCLC患者临床试验

(1)LUX-Lung 1:LUX-Lung 1是Miller等［37］开展的一项Ⅱb/Ⅲ期的研究，针对阿法替尼与安慰剂的随机、双盲临床试验，受试者为晚期NSCLC，既往接受过多种治疗，阿法替尼是三线或四线治疗。该实验是2010年10月在ESMO(European Society for Medical Oncology，欧洲临床肿瘤协会)的35个中心开展的［38］。总共有585例受试者参与此项研究中。有趣的是，阿法替尼并没有达到主要观察点OS的改善，但是在次要观察点PFS、ORR(objective response rates，客观反应率)上均有提高。阿法替尼的中位OS是10．78个月，安慰剂组的中位OS是11．96个月。在这些难治的NSCLC患者中，安慰剂组的中位OS明显的比阿法替尼组要高。该现象可能是安慰剂组的患者出现疾病进展后会继续接受化疗或其他EGFR-TKIs治疗。阿法替尼和安慰剂组的中位PFS是3．3个月vs 1．1个月，独立评估治疗8周后的疾病控制率在阿法替尼组是58%，安慰剂组的是19%。阿法替尼组与安慰剂组的ORR分别是(11%vs 0．5%)。阿法替尼组对PFS上的获益及肿瘤引起的相关症状如咳嗽、呼吸困难、疼痛改善方面是有临床意义的。尽管在OS上没有明显的提高，这项实验仍然提示了阿法替尼对既往接受过化疗及EGFR TKIs治疗的晚期NSCLC患者在治疗上的重要意义。

(2)LUX-Lung 2:LUX-Lung 2实验是一项Ⅱ期临床实验，旨在研究阿法替尼作为EGFR TKIs初次治疗潜在EGFR激活突变的NSCLC患者的作用［39］。对中国台湾地区和美国的444个ⅢB/Ⅳ期的肺腺癌患者，分别进行了EGFR突变检测，使用的是直接测序法，测定18-21外显子的突变水平，其中129名患者纳入了该项研究。尽管可以接受一线的化疗，但是他们却采用了厄洛替尼或吉非替尼作为一线药物治疗。该实验采用影像学来评估治疗结果。62个19外显子突变患者的ORR和疾病控制率(disease control rates，DCR)均为94%，L858R突变患者的ORR和DCR分别是52%和85%，其余突变的ORR和DCR分别是43%和78%。该实验结果与EGFR激活突变患者一线应用吉非替尼的效果相当，但是与目前应用的可逆的EGFR TKIs没有明显优势。中位的PFS是12个月，常见的不良反应是皮疹和腹泻。

目前，3项研究阿法替尼在肺癌患者中作用的Ⅲ期国际性实验正在开展，其中包括LUX-Lung 3和LUX-Lung 6(不同地区、种族)，受试者都是EGFR激活突变的患者，分别进行了一线阿法替尼和顺铂/培美曲塞的对比。首要的观察点是PFS，其他的观察指标是DCR、OS、健康相关的生活质量等。LUX-Lung 5进行的是吉非替尼、厄洛替尼治疗失败后，采用阿法替尼再次治疗疾病进展患者的阿法替尼联合化疗结果。

四、结语

EGFR是肺癌患者促有丝分裂和转化的一个重要靶点。尽管早期针对EGFR的一些可逆性小分子TKIs取得了一线成就，但是随着治疗时间的延长，不可避免的出现了耐药。然而新的可逆性双重EGFR-HER2阻滞剂如拉帕替尼(lapatinib)在肺癌患者身上并没有明显的获益［40］。不可逆性双重EGFR-HER2阻滞剂PF299804和BIBW2992的发展为EGFR激活突变的患者带来了希望。阿法替尼在Ⅰ期和Ⅱ期NSCLC患者的实验结果为临床治疗提供了新的手段，尽管有患者可耐受的副作用如皮疹和腹泻等存在。但是与安慰剂相比，阿法替尼在既往接受过可逆性EGFR TKIs治疗的患者身上并没有明显的改善OS。既往的实验中也观察到在吉非替尼耐药的NSCLC细胞系中，阿法替尼同样下调了胸苷酸合酶(thymidylate synthase，TS)。当阿法替尼与针对TS靶点的药物如培美曲塞等联用时，可以观察到对T790突变的NSCLC明显的协同生长抑制作用［41］。现在已经有实验通过检测肿瘤组织TS水平去观察培美曲塞耐药相关性，这也合理的解释了高表达TS的鳞癌患者中培美曲塞效果不佳的原因。这提示我们可以对可逆性EGFR TKIs耐药的患者进行阿法替尼与培美曲塞的联用，尤其是对T790M突变的患者。在以后的治疗中我们可以检测EGFR、HER2突变水平及肿瘤组织TS的水平。检测这些对EGFR靶向治疗的预测因素是下一步临床试验设计的重要组成部分，也是我们生物治疗向前发展的一个重要转折点。

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41 Takezawa K，Okamoto I，Tanizaki J，et al．Enhanced anticancer effect of the combination of BIBW2992 and thymidylate synthasetargeted agents in non-small cell lung cancer with the T790M mutation of epidermal growth factor receptor［J］．Mol Cancer Ther，2010，9(6):1647-1656．