细胞外信号调节激酶在蛛网膜下腔出血损伤中的作用及意义

李 冉， 刘 江， 崔建忠， 王凯杰， 徐爱军， 王海涛， 高俊玲

蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)可导致颅内发生一系列并发症，是患者病残和死亡的主要原因［1］。研究证实SAH后血管壁内皮细胞凋亡现象在SAH病理进程中起关键作用［2］，最终可导致脑损伤后期的神经功能缺陷［3］。细胞凋亡多通过半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(cysteine asparti cacid-specific protease，caspase)介导的信号途径完成，细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)级联途径是SAH后重要的信号转导通路，已有研究证实脑缺血性损伤中ERK在炎性反应等方面发挥了重要作用［4］，应用ERK抑制剂U0126预处理可减少脑创伤模型60%的脑部损伤面积［5］。类似机制是否存在于SAH模型小鼠神经元凋亡过程仍不清楚。近年的研究多集中于SAH后迟发性脑血管痉挛(cerebral vasospasm，CVS)及并发症的防治，对SAH早期脑损伤分子机制研究甚少。本研究对ERK、caspase-8在小鼠SAH损伤中的作用进行研究，旨在探讨ERK通路在SAH早期脑损伤中的分子机制。

1 材料和方法

1．1 材料 β-actin鼠单克隆抗体(Sigma)，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔/兔抗小鼠IgG(Sigma)，预染蛋白 Marker(灏洋生物)，phosphorated-ERK多克隆抗体(Cell signaling)，TUNEL试剂盒(Roche)，U0126(Promega)，caspase-8 兔抗鼠多克隆抗体(Santa cruz biotechnology，Inc)。健康雄性ICR小鼠由北京维通利华动物中心［SCXK(京)2002-2003］90只，体质量28～32g，随机分为假手术对照组(Sham组)18只;模型组(SAH组)36只;U0126干预组(SAH+U0126组)36只，各组分为SAH 12、24、48h 3 个亚组。

1．2 方法

1．2．1 动物模型的制备 参照文献［6］的方法并略作改良，麻醉消毒后，于手术显微镜下自小鼠右侧颈外动脉(ECA)经颈内动脉(ICA)导入5-0单纤维尼龙线，至大脑前动脉(ACA)与大脑中动脉(MCA)分叉处，刺破动脉壁，总进入长度约为(10±0．5)mm。假手术对照组将尼龙线仅送至ACA与MCA分叉处，稍感阻力即停止继续插入，并迅速退出尼龙线。结扎颈外动脉的断端，缝合皮肤，单笼饲养。将UO126溶解于DMSO中，于出血前30min 经尾静脉注射(0．05mg/kg，0．1mg/kg)，出血前30min、24h、48h 各给药一次。

1．2．2 MCA形态学观察 常规HE染色，光学显微镜下观察MCA形态学改变。

1．2．3 TUNEL法检测大脑中动脉内皮细胞凋亡 小鼠麻醉开胸，70mmHg压力下经左心室灌注等渗盐水至流出液体清亮，4%多聚甲醛PBS(pH 7．2 ～7．4)缓冲液 100ml灌注，断头取脑，取大脑中动脉至大脑前动脉分叉处前后3mm范围的脑组织冠状切开，入4%多聚甲醛室温后固定2h，入4℃20%蔗糖磷酸盐缓冲液，应用恒冷箱切片机连续冠状切片，片厚20μm。按原位细胞凋亡检测试剂盒提供的实验步骤进行，DAB显色。采用CMIAS真彩色医学图像自动分析系统进行TUNEL阳性细胞计数，随机记数小鼠MCA阳性细胞数。

1．2．4 免疫印迹法检测大脑动脉p-ERK1/2、caspase-8蛋白表达 10%水合氯醛(0．30ml/kg)腹腔注射麻醉动物后断头取脑，于手术显微镜下低温快速分离右侧大脑动脉(ICA、ACA、MCA)，置于4℃预冷的全细胞裂解液0．6ml冰水浴中匀浆，12000r/min 4℃离心5min，取上清液。以考马斯亮蓝G250结合法蛋白定量，－80℃保存备用。取15μg蛋白样本加入2×SDS凝胶加样缓冲液，煮沸5min，6000r/min离心3min，取上清液上样，用12%(w/v)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后室温下封闭2h，分别加入p-ERK1/2、caspase-8一抗4℃过夜，加辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗和预染蛋白Marker，室温下震荡孵育1h，滤膜漂洗后加入 DAB显色。将特异性蛋白条带进行扫描后，在同一条件下应用CMIAS真彩医学图像分析系统测定目标条带整合光密度值(IDV)，计算出各组样品目标条带与内参(β-actin)的IDV比值。

1．2．5 统计学处理 实验中所得数据均以均数±标准差(±s)表示。应用SPSS 12．0软件，对其进行单因素方差分析，相关因素进行相关分析，以P＜0．05表示差异有统计学意义。

2 结果

2．1 颅底解剖学检查 假手术组无出血。SAH造模后各时间点均有明显出血，累及整个Willis环，尤以右侧为著;SAH 48h出血部分吸收，可见陈旧性血块附着于Willis环周围，符合SAH研究要求。

2．2 MCA形态学改变 假手术组MCA管腔光滑，内皮细胞排列平整。与假手术组相比，SAH 48h MCA呈现强力收缩，HE染色下内弹性膜呈波纹状皱缩，内皮细胞肿胀，排列不整齐，被邻近波纹状的内弹性膜扭曲而突向腔内，血管壁显著增厚，管腔明显狭窄，平滑肌细胞收缩，个别内皮细胞脱落。U0126可缓解CVS，改善内皮细胞及平滑肌细胞坏死。

2．3 TUNEL检测MCA细胞凋亡结果 假手术组偶见TUNEL阳性细胞(1．305±0．12)。模型组12h TUNEL阳性细胞开始增加，48h达高峰，细胞胞质浓缩，染色质凝集，核深染，呈深棕色颗粒状，阳性细胞在MCA所有层面均有表达，尤以内皮细胞及中膜平滑肌细胞为著，SAH12、24、48h差异均有统计学意义(11．253 ± 0．121，33．663 ± 0．118，58．174 ±0．115;均P＜0．05)。U0126 干预组各时相点TUNEL阳性细胞均不同程度减少，24、48h差异有统计学意义(29．312 ±0．119，41．327 ±0．117;均P＜0．05)。

2．4 免疫印迹法检测结果

2．4．1 p-ERK1/2蛋白免疫印迹法检测结果假手术组少量p-ERK1/2表达;模型组p-ERK1/2在出血后12h明显增加，24h达高峰，48h降低，12、24、48h差异均有统计学意义(P＜0．05)。U0126干预组各时相点p-ERK1/2表达均有不同程度降低;24、48h差异有统计学意义(P＜0．05)。

2．4．2 caspase-8蛋白免疫印迹法检测结果假手术组caspase-8少量阳性表达，模型组12h蛋白量明显增加，24h达高峰，48h降低，但仍高于基础水平，12、24、48h 差异均有统计学意义(P＜0．05)。U0126干预组各时相点caspase-8表达均有不同程度降低;12、24、48h差异均有统计学意义(P＜0．05)。

3 讨论

本实验显示模型组小鼠痉挛大脑动脉TUNEL染色呈阳性，在MCA所有层面均有表达，说明凋亡在SAH损伤中发挥了重要作用。研究证实SAH后血管壁细胞凋亡和在此基础上出现的血管壁增生及构建相关［7］，因此，减少或阻断细胞凋亡通路是保护脑组织的一个重要的治疗方向。

神经元凋亡与出血后脑组织复杂的信号转导通路激活具有相关性，其中丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)家族中的 ERK通路发挥了重要作用。有研究表明利用多巴胺能受体转基因小鼠发现ERK激活主要发生在直接转导通路中［8］。本实验中SAH24h p-ERK1/2表达达高峰，随时间延长TUNEL阳性细胞增加，提示本次实验条件下，ERK的激活可能导致了细胞凋亡，出血后凋亡的发生与 CVS密切相关［9］，p-ERK1/2在CVS进程中起了重要的作用［10］。ERK1/2是一种重要信号转导蛋白，当有害刺激信号作用于细胞表面受体时，可激活GTP结合蛋白RAS，继而激活Raf-1，Raf-1可磷酸化MEK，p-MEK进一步磷酸化ERK1/2，之后p-ERK1/2使细胞核内的Elk-1磷酸化，此瀑布式磷酸化活化过程将激活与细胞损伤有关的即刻反应基因和晚反应基因的表达，调节细胞的生长和分化。Aoki等［11］利用两次注血 SAH模型观察到，注血可造成基底动脉CVS，MEK抑制剂PD98059可明显降低ERK1/2表达水平，并且可显著逆转CVS，使痉挛的血管内径增加。本实验中颅底解剖可见大量出血，镜下观察显示出血可导致SAH小鼠MCA管腔狭窄、管壁增厚，受伤小鼠患侧对侧肢体瘫痪，出现左旋追尾现象，说明SAH后强烈的血管痉挛可能造成行为学改变。ERK表达高峰早于TUNEL阳性标记的高峰，说明ERK发生时间早于凋亡;抑制剂组p-ERK1/2的表达水平明显低于模型组，提示U0126可通过调节p-ERK1/2的活化水平而影响凋亡进程，可能对出血性脑损伤具有保护作用。

为明确p-ERK1/2是否诱导了caspase凋亡通路，本实验应用ERK抑制剂，并检测了下游caspase-8表达。caspase属于半胱氨酸蛋白酶家族，由上游启动型caspase激活下游效应caspase组成瀑布式级联反应。启动型caspase包括caspase-2、8、9和10，通过自身活化启动凋亡程序并调节效应型caspase-3;效应型caspase包括caspase-3、6和7，能分解细胞蛋白引起细胞凋亡。caspase蛋白酶主要以无活性酶原形式存在于细胞质中，受到凋亡刺激后被激活，直接参与凋亡早期启动和凋亡信号的传递。本实验观察到出血后caspase-8免疫反应阳性神经元不断增加，至SAH 48h与凋亡细胞数目同时达高峰，进一步说明caspase-8活化可能是SAH后细胞凋亡的关键环节之一。研究证实caspase-8是关键的启动型caspase，其可通过特殊的细胞信号途径导致caspase-3激活，将凋亡信号传至caspase-3，caspase-3活化物能裂解DNA修复酶，使细胞不可逆地发生凋亡改变，包括核浓缩和 DNA断裂，最终导致细胞凋亡［12］。

本实验中ERK抑制剂U0126在抑制p-ERK1/2的同时部分阻抑了caspase-8的活化，提示ERK可能位于上游并可活化caspase-8。应用U0126可在脑损伤的启动阶段通过阻抑p-ERK1/2、caspase-8等一系列级联因子的作用，减少凋亡细胞的增加，在损伤的上游阶段阻断病情发展，其对出血性神经损伤可能具有一定的靶向作用。

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