内皮特异性分子1在肿瘤治疗中的研究进展

范旻浩， 李婷， 张群岭，胡夕春

内皮特异性分子1(endothelial specific molecule-1，ESM-1)，也称为endocan，作为一种由内皮细胞分泌的可溶性产物，最初是由Lassalle等人于1996年在人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)的 cDNA文库克隆时意外发现的，同时发现其在肺组织和肾组织来源的血管内皮细胞中表达。近年来研究显示，ESM-1可能通过多种信号传导途径参与体内的炎症反应、血管生成以及肿瘤的发生和发展等病理生理过程，并在肿瘤预后、抗血管药物疗效预测等方面具有潜在的应用价值。

1 ESM-1的基因结构

ESM-1由人类5号染色体5q11.2上的单一基因编码，含有3个外显子和2个内含子。1号外显子长362bp，2号长150bp，3号长1560bp。其中1号和部分2号外显子编码一个含有110个氨基酸，并且富含半胱氨酸的氨基末端。2号外显子同时编码一个富含F(113FPFFQY118)的特殊区域，该区域被认为与ESM-1的功能密切相关。最大的3号外显子编码ESM-1蛋白羧基端33个氨基酸区域，该区域含有提前终止密码子和137位丝氨酸上的O-糖基化位点。

2 ESM-1的基因产物与表达调控

2.1 ESM-1的分子结构 ESM-1是一种分子量50 kDa的由内皮细胞分泌的可溶性硫酸皮肤素蛋白多糖(dermatan sulphate proteoglycan，DSPG)。完整的ESM-1分子包含165个氨基酸的核心蛋白以及以共价键的形式连接在第137位丝氨酸残基上的一条黏多糖单链，即硫酸皮肤素链。硫酸皮肤素是由N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)和葡萄糖醛酸(GlcA)或艾杜糖醛酸(iduronate，IdoA)二糖重复单位构成的线性多糖。其中艾杜糖醛酸成分是ESM-1的重要功能结构。现已有的多项研究在健康志愿者、脓毒症患者及肿瘤患者的血清和组织标本中检测到以蛋白多糖形式存在的ESM-1［1-4］。对于研究者来说，以HUVEC为代表的血管内皮细胞模型ESM-1的表达量很低，往往不能满足科研需要，Sarrazin等［3］通过基因重组建立的人体肾脏胚芽细胞模型(HEK293)，能够长周期高水平表达具备DS活性链的ESM-1蛋白聚糖分子，其ESM-1产量超过传统细胞模型60倍(174.3 ± 49.7 μg/mL vs.2.9 ±1.1 μg/mL)，这一成果为深入研究ESM-1以及其他新近发现的糖基化细胞因子提供了条件。

2.2 ESM-1的选择性表达 基因在转录过程中的选择性剪切使编码ESM-1的基因能产生两种截然不同的表达产物:一种是成熟的ESM-1分子，包含完整的核心蛋白、F113和F116位的苯丙氨酸富集区以及硫酸皮肤素黏多糖单链。ESM-1的促癌作用主要与黏多糖单链和苯丙氨酸富集区相关;另一种产物较正常的ESM-1分子缺少了2号外显子区域，称之为 endocanΔ2。Depontieu 等［5］的 研 究显 示endocanΔ2不具备促肿瘤生长的作用，具体表现在:与ESM-1相比，endocanΔ2多肽链与硫酸皮肤素黏多糖单链(DS链)的结合率下降(47.4%;95%CI:42.9% ～50.2%)，其作用下的裸鼠移植瘤体积更小(0.04 cm3vs.1 cm3)，在非小细胞肺癌组织中未能检测到其含量的升高。这项研究明确ESM-1基因2号外显子所编码的苯丙氨酸富集区以及含艾杜糖醛酸的硫酸皮肤素链是ESM-1的主要功能区域。基因的选择性剪切也许是ESM-1功能调节机制的一部分。

2.3 ESM-1的表达调控 ESM-1表达水平受一系列炎症介质、细胞因子调控。许多炎性介质，如肿瘤坏死因子α、白细胞介素1等均能促使ESM-1高表达。Sarrazin等［6］的研究显示，ESM-1基因表达水平可受革兰氏阴性细菌细胞壁上的脂多糖(LPS)上调。在体外试验中，加入肿瘤坏死因子α、白细胞介素1和(或)细菌脂多糖后，内皮细胞分泌ESM-1的水平上升，这种上升可持续72 h以上［7］。严重脓毒症患者血清ESM-1水平尤其高，提示血清ESM-1表达水平和炎性因子释放相关［8］。研究发现ESM-1表达水平和某些血管生成因子，如血管内皮生长因子VEGF-A、成纤维生长因子FGF-2之间有较强的相关性。Aitkenhead等［9］利用 cDNA探针和Northern blot发现，体外培养的血管内皮细胞在VEGF和FGF-2刺激下ESM-1基因表达水平上升了4倍。其可能的机制是，ESM-1的DS链与FGF-2结合并且促进FGF-2依赖的血管内皮细胞增殖，从而导致新生血管形成。而 VEGF-A通过3-磷酸肌醇激酶(phospho inositide 3-kinase，PI3K)-Akt信号通路上调ESM-1的表达［10］。目前发现其他对ESM-1有肯定上调作用的因子还包括蛋白激酶C激活剂、维甲酸、核因子κB、VEGF-C等。

3 ESM-1的作用机制

3.1 激活肝细胞生长因子/离散因子转导通路 肝细胞生长因子/离散因子(hepatocyte growth factor/scatter factor，HGF/SF)是一种间叶细胞和基质细胞来源的生长调节因子，能促进内皮和上皮细胞的生长发育及分化，被认为与胚胎时期器官的形成有关，异常表达时则促进肿瘤细胞的增殖和转移［11］。IdoA在ESM-1和HGF/SF的特异性联系过程中扮演了重要角色。IdoA与HGF/SF结构中的O-硫酸己糖胺结合，这种结合对HGF酪氨酸受体C-met的活化及其介导的细胞信号通路极其重要，C-met作为HGF的唯一受体蛋白，由原癌基因C-met编码，被激活后导致ras/致分裂素激活蛋白激酶、PI3K/蛋白激酶B等信号转导途径的级联激活，使细胞发生一系列的生物学效应，如分散、侵袭、细胞运动、细胞迁移，最终与肿瘤发生、肿瘤血管生成及肿瘤转移相关。

3.2 抑制肿瘤免疫监控 正常机体免疫系统对肿瘤细胞具有监控和杀灭作用，这一作用通常由T细胞发挥细胞毒作用完成，而T细胞和肿瘤细胞的接触往往需要通过血管内皮屏障。ESM-1抑制淋巴细胞和单核细胞表达的细胞粘附分子1(ICAM-1)和淋巴细胞功能相关性抗原1(LFA-1)间的相互作用，ESM-1 DS链上的硫酸根结合位点与LFA-1相互作用，改变后者构型，干扰LFA-1与ICAM-1的结合，从而抑制LFA-1介导的淋巴细胞功能。譬如淋巴细胞对内皮的粘附以及跨内皮细胞迁徙，干扰淋巴细胞的归巢和聚集，阻断T细胞和肿瘤细胞的接触通路。这一机制同样影响了自然杀伤细胞对肿瘤的结合杀伤，De Freitas等［12］研究发现 ESM-1剂量相关地对NK细胞在内皮中迁徙起抑制作用。

3.3 促进肿瘤血管和淋巴管生成 成纤维生长因子FGF-2和血管内皮生长因子VEGF是血管内皮增殖、萌芽、成型过程中的特异性刺激因子。如前所述，ESM-1的DS链能与FGF-2结合并促进FGF-2依赖的血管内皮细胞增殖，VEGF-A则通过PI3KAkt信号通路调节ESM-1的表达。体外研究显示，ESM-1能促进血管内皮细胞有丝分裂，Gerritsen等［13］发现，在培养中的血管内皮细胞中，FGF-2、VEGF-A/C、HGF等与ESM-1呈正反馈式地相互促进表达，与此同时血管内皮细胞增生更为明显，且更易形成管状结构。然而，单独加入ESM-1则对内皮细胞功能无影响［14］。另外，ESM-1对淋巴管形成也有促进作用，Shin等［15］分别用细胞培养和小鼠体内试验的方式证明ESM-1和VEGF-A、VEGF-C可相互促进，共同引起淋巴管内皮细胞的增殖和迁徙，而单独存在ESM-1或VEGF-A/C时则无类似效果。这同样验证了ESM-1促血管淋巴管生成作用需要间接通过FGF-2、VEGF来实现。

4 ESM-1的应用价值

4.1 肿瘤血管生成标志 肿瘤的生长有赖于血供营养，血管生成在富血管肿瘤，如肾细胞癌、肺癌、成神经胶质细胞瘤的发生发展中起着关键作用［16-17］。肿瘤血管内皮细胞的生物学行为不同于正常血管内皮，往往是杂乱的、连接松散的、出芽分枝丰富的、错乱的蜂窝状血管墙。找到一种能够特异性反映肿瘤血管内皮细胞活性的生物标志物，尤其是当针对肿瘤细胞本身的标志物缺乏或应用抗血管靶向药物时，就显得十分必要。

目前已存在多种对血管生成具有预测作用的生物标志物，包括组织学和血清学指标，如微血管密度(microvessel density，MVD)、血管内皮生长因子、可溶性血管内皮生长因子受体(sVEGFR)等。但这些标志物无法全面并特异地反映肿瘤新生血管情况，且取材困难。而ESM-1在各种体外培养增殖中的血管内皮细胞，包括冠状动脉、肺动脉、毛细血管来源的内皮中都有高表达，而在富含血管的大脑、肝脏、心脏等器官标本中却无表达上调［9］，提示ESM-1并不在休眠期的血管内皮细胞中表达，因而可以特异性反映内皮细胞增殖活性。Almog等［18］在一项包含乳腺癌、成胶质细胞瘤、骨肉瘤和脂肪肉瘤的裸鼠移植瘤模型研究中验证了潜伏期肿瘤向高增殖富血管肿瘤转化和ESM-1基因表达水平的高度相关性，在所有测试的髙增殖富血管肿瘤系中ESM-1水平均显著上升，特别在成胶质细胞瘤和脂肪肉瘤中，ESM-1基因表达水平增加了30倍。Depontieu等［5］和Recchia等［19］用肾胚芽细胞293和视网膜血管所做的动物模型也分别显示ESM-1的上升能促进肿瘤生长和血管生成。

通过基因原位杂交、免疫组化等方法，研究者们陆续在多种组织器官来源的肿瘤中发现ESM-1基因及其产物过表达现象。Grigoriu等［7］用逆转录PCR的方法分析24例非小细胞肺癌患者的手术标本，发现相对周边正常组织，肿瘤组织ESM-1-mRNA上升了2.5 倍(P=0.029)。Leroy 等［4］通过免疫组化分析44例肾透明细胞癌患者肿瘤标本，其中40例出现ESM-1高表达，主要表达部位在血管内皮细胞胞浆内，同时该研究还发现其中14例患者血清ESM-1水平较正常对照上升了3～10倍。Buckanovich等［20］也使用基因探针分析卵巢癌肿瘤血管相关因子时证实ESM-1基因相对正常组织高表达。而免疫学查找胞浆ESM-1的方法则证实肺、脑、肝、肾来源的肿瘤血管内皮细胞胞浆ESM-1水平升高［10，14，21-22］。然而，Zuo 等［23］的研究发现，在结肠腺癌组织中ESM-1的表达反而下降，mRNA及其产物的表达率分别是36.1%和33.3%，而正常对照组织中相应数值是70.4%和92.6%。同时他们还发现ESM-1表达水平与年龄、性别、临床分期、肿瘤大小及淋巴结转移情况都无关，但和肿瘤的分化程度正相关，即分化越好，ESM-1水平越高。同样的情况在胃腺癌中也有出现，Zhang等［24］发现胃腺癌组织较正常组织ESM-1表达下降(30.1%vs.58.5%，P＜0.05)，且与分化程度正相关。消化道肿瘤这一有别于大多数情况的研究结论如能被反复证实，也许有助于深入揭示ESM-1在不同肿瘤发生发展过程中所扮演的角色。

鉴于血管生成是肿瘤增殖进展的因素之一，ESM-1作为血管生成相关因子，自然被看做是潜在的预后指标。van't Veer等［25］在使用基因芯片分析78例乳腺癌患者预后相关基因时发现，预后好(5年内无远处转移)的35例患者ESM-1基因高表达的比例为5/35，预后差的43例患者这一数值则为18/43，这一研究共包含70项被认为与乳腺癌预后可能相关的基因。Grigoriu等［7］对30例非小细胞肺癌(NSCLC)患者的随访研究发现，总生存期(overall survival，OS)与血清 ESM-1 水平(P=0.013)、肿块大小(P=0.011)、淋巴结分期(P=0.03)、远处转移情况(P=0.002)有关，而与性别、年龄、组织学类型(鳞癌、腺癌等)无关。血清ESM-1水平低于和高于1.3 ng/mL的两组患者中位总生存期有明显差异(6个月vs.3个月)。但COX分析显示只有当远处转移情况不纳入考虑时ESM-1才是OS的预测因子，因此认为ESM-1升高并非是NSCLC独立预后因子，TNM分期依旧是NSCLC最主要的生存预后因子。Huang等［22］对90例肝细胞癌(HCC)患者的研究中，将ESM-1标记的微血管密度(ESM1-MVD)作为观察指标，发现低ESM1-MVD组1、2、3年生存率比高 endocan-MVD 组都高(77.0%，42.7%，33.7%vs.47.6%，12.8%，0%;P ＜0.01)。同时多变量分析还显示ESM1-MVD是HCC患者总生存的独立预后因素(HR=3.31)。

4.2 抗肿瘤血管生成靶向治疗预测因子 如前所述，ESM-1的表达随VEGF的上调而上调，因而可以作为一种潜在的反映抗VEGF-VEGFR通路药物活性的检测指标。Grigoriu等［7］在体外培养的内皮细胞上所做的研究显示，加入抗VEGF抗体后，可剂量依赖性地抑制VEGF介导的ESM-1表达水平，当抗体剂量达到0.1 μg/mL时ESM-1表达几乎被完全抑制(95%)。而抗 VEGF受体类药物也可下调ESM-1。Hardwick等［26］通过基因芯片的方法发现，接受VEGF受体2酪氨酸激酶抑制剂处理后ESM-1基因被显著抑制。Leroy等［4］在体外培养的 VEGF诱导下的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中加入舒尼替尼后，ESM-1的表达水平下降(IC50=5 ng/mL)。体内方面，ESM-1作为药物疗效预测指标的临床研究尚不多见，值得一提的是Hatfield等［27］于2011年在对40例急性髓性白血病(AML)的研究中将ESM-1做为主要观察指标，发现:(1)AML患者血清ESM-1水平相比对照组有明显升高，平均为0.7 ng/mL，最高6.8 ng/mL，而对照组(21名健康志愿者)最高为0.2 ng/mL;(2)经过阿糖胞苷强化治疗后患者血清ESM-1水平显著下降(Wilcoxon’s test，P=0.0004);(3)合并感染的患者血清ESM-1水平上升(P=0.003);(4)ESM-1并非肿瘤细胞本身所分泌，因为体外培养的AML细胞并无ESM-1表达，且治疗期间ESM-1水平变化与骨髓AML细胞增殖情况无关。实体瘤方面，Zhang等［24］用 RT-PCR和Western blot的方法分析经褪黑素处理的胃腺癌细胞，发现ESM-1表达上调，但这一研究仍然停留在体外水平。

由上可见，体外内皮细胞ESM-1的释放可被抗VEGF/VEGFR药物所调节，同时，血清ESM-1水平与性别、年龄、遗传特征、细胞形态等个体差异无关。故ESM-1也许可以作为反映肿瘤对抗VEGF/VEGFR类药物疗效的标志物。但其血清水平受机体感染、骨髓激活等诸多临床常见混杂因素影响，作为预测因子时须注意排除此类因素的干扰。

5 结语

ESM-1通过抑制激活HGF介导的原癌基因转导通路，肿瘤免疫监控，与VEGF、FGF-2等协同促进肿瘤血管和淋巴管增生，起到促进肿瘤生长的作用。现有的反应血管增生的指标，如MVD、VEGF等，无法全面并特异地反映肿瘤新生血管情况。ESM-1不在休眠期的血管内皮细胞中表达，因而可以反映内皮细胞增殖活性，对于富血管肿瘤的生长情况具有预测价值。同时ESM-1的表达水平与VEGF的相关性，提示其可以作为一种潜在的反映抗VEGFVEGFR通路药物活性的检测指标，未来应充实其临床应用方面的研究。鉴于ESM-1能够通过多种途径促进肿瘤生长，开发相应的靶向治疗药物也许能提供肿瘤治疗的新手段。

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