神经再生在种植体骨感知中的作用*

徐 娟 胡 敏

近年来，随着牙种植机制基础研究的发展和材料科学的进步，种植体支持的义齿得到越来越多的临床应用。患者在种植义齿后，咀嚼和触觉功能得到很大程度的恢复，研究表明，患者在种植义齿后，在咀嚼活动时的压痛，咀嚼疲劳和肌肉协调性等方面，和天然牙齿并无很大差异，并在进行习惯性咀嚼活动时表现良好的适应性[1]。这表明，牙种植体和其所在的口颌面部组织形成结构上和功能上的整合，这种来源于种植体以及周围组织并经外周神经系统和中枢神经系统整合而形成的类似天然牙的本体感受觉被称为骨感知。骨感知是一种与种植体有关的机械感受，这种机械感受来源于骨锚着体受到的机械刺激，由位于肌肉，关节，黏膜，皮肤以及骨膜组织内的机械感受器传导，最后经由中枢神经系统的感觉运动功能改变而实现[2]。拔牙或牙齿损伤后的神经再生包括了感觉神经轴突的再生、神经末梢的再生和牙周膜的重建，在此过程中许多生物活性物质的表达发生明显改变，现将上述过程综述如下，同时也探讨了干细胞移植技术和组织工程学方法来重建种植体周围的感觉神经支配。

1.种植体周围的感觉神经支配

咀嚼和撕咬等口腔活动依赖神经系统的精密调节，来自口腔及其周围组织的感觉输入是神经调控的重要环节。口腔运动涉及了诸多组织内感受器的活动，这些感受器存在于牙周膜，口腔黏膜上皮，牙龈，骨，骨膜和舌等部位。其中牙周膜内的机械感受器分布非常密集，而且非常敏感。口腔的黏膜内也存在大量的感觉神经末梢，包括迈斯纳氏小体(Meissner's corpuscules)，小球样末端(glomerular endings)，鲁菲尼样(Ruffini)末梢和自由神经末梢。牙龈内包含了圆形和椭圆型的环层小体，这些感受器也可以对机械刺激产生反应，并参与嘴唇和口腔肌肉在咀嚼活动时的协调。皮肤机械感受体可以在面部皮肤伸展和皱缩时激活，作为本体感受器参与面部运动觉和运动的控制。骨膜内包含了自由神经末端，无包绕末端和有包绕末端，自由神经等末端可以在咀嚼肌和皮肤活动时引发的骨膜伸展中被激活[3]。

牙周膜(Periodontal ligament)内分布着大量的感觉神经末梢，多以鲁菲尼氏(Ruffini)末梢和树突样末梢的形式，呈严密的网络结构包绕在牙体周围。感受牙体所受的机械刺激，并将这些信号经上&下牙槽由神经传入脑干以及皮层的中枢，最后由中枢形成感觉-运动反馈。

当牙齿被拔除后，牙周膜组织受到破坏，但是下牙槽神经内的有髓鞘包绕的纤维仅减少20%，这个现象提示原来支配牙齿和牙周膜的神经纤维仍然存在。这些神经纤维可能出现再生，组织学的证据表明，种植体种植后给予咬合负重，负重部位的牙周组织内出现许多神经纤维蛋白(Neurofilament protein，NFP)阳性神经末梢，而未负重组则没出现。这些纤维出现在骨髓和种植体周围的纤维状组织中并呈现两种不同的神经末端，一种是自由末端，第二种是树枝样分叉末端。有一项研究显示，种植体表面出现了牙周膜的部分再生，然而目前尚不清楚这种再生是否会导致神经反射活动的重建[4]。

结合上皮(Junctional epithelium)是牙龈上皮附着在牙表面的一条带状上皮。天然牙的结合上皮内存在着丰富的感觉神经末梢。一项组织学研究表明，32-42天大的大鼠其结合上皮内有大量P物质阳性神经纤维，其中结合上皮中间部的密度最高，另外，结合上皮的基底细胞层内也有大量的神经支配。这些末梢在结合上皮的许多区域形成曲张样小体，少数P物质阳性神经纤维末梢一直延伸到牙釉质表面[5]。这些现象表明，结合上皮内的神经末梢参与了咀嚼活动时的感觉信息传入。

种植体周围新生的上皮组织在组织形态方面和天然牙龈的结合上皮很形似，免疫组化结果表明，种植体周围上皮和天然牙龈上皮，其细胞角蛋白(cy tokeratins)和细胞间粘附因子-1(Intercellular Adhesion Molecule1，ICAM-1，作为三种牙龈上皮的标志分子)的表达水平和分布几乎一致。大鼠上颌骨种植钛种植体的形态学研究表明，对照组大鼠的结合上皮内有丰富神经元特异性PGD9.5(Protein gene product 9.5，PGD95)和降钙素基因相关肽(Calcitonin gene-related peptide，CGRP)阳性神经末梢。种植后第20天到30天，种植体周围的上皮组织内出现PGD9.5和降钙素基因相关肽阳性神经末梢，其表达水平和天然上皮接近或者稍低[6]。这提示，种植体周围新生上皮组织也有丰富的神经支配，并可能构成重要的种植体骨感知感觉信息的输入来源。

2.种植体骨感知在中枢神经系统的整合

如前所述，种植体的骨感知活动中，种植体周围有多个不同来源的有别于正常牙齿的感觉输入，另外，咀嚼和撕咬活动也和口腔颌面部的肌肉，关节内的位置觉，运动觉和震动觉以及皮肤和黏膜内痛、温觉和触觉活动有关。这些感觉刺激首先投射到脑干的感觉神经元，如三叉神经感觉核，并经由此处的神经元进一步投射到大脑皮层的相关区域形成完整的神经投射通路。而大脑的高级皮层可以发生可塑性变化，以适应新的感觉投射，并对种植体上的义齿和其他天然牙体的活动进行协调，进而产生新的活动模式[7]。

因为大脑皮层和相对应的躯体部位有严格的投射关系，因此投射区的改变比如肢体切断，受伤或者给予种植体，都可能改变相关皮层的活动。一项实验表明，鼹鼠的下右侧门牙被拔除后8个月，颌面部在皮层上的投射区发生了明显的重组。

3.感觉神经末梢的再生

如上所述，种植体支持义齿的骨感知涉及种植体周围组织的适应性改变以及大脑皮层可塑性的调节。在牙周膜缺失的情况下，种植体周围牙龈内以及结合膜内感觉神经末梢的再生可能是种植后骨感知最重要的环节之一，因为这些再生的感觉末梢，可以在某种程度上重建种植部位组织的感觉投射，从而使皮层的中枢调节成为可能。尽管口腔颌面部的其他的肌肉和关节以及面部皮肤内的感受器也可能参与了骨感知的建立，但他们可能仅发挥一些次要的作用。下面将主要讨论感觉神经轴突，末梢的再生和牙周膜的重建。

3.1感觉神经元轴突的再生 人体组织受损伤后(比如拔除牙齿使牙周膜甚至牙龈和牙槽骨骨膜受到损伤)，支配这些组织的周围神经因为失去支配对象而发生变性。在拔牙后造成的神经变性中，支配口腔感觉的牙槽神经其末梢开始出现逆行性轴突变性，这种神经末端的变性称为华勒变性(W allerian degeneration)。华勒变性可以引发髓鞘解体，雪旺氏细胞增殖以及巨噬细胞活化。另外，轴突内的微管和微丝等骨架结构也因水解而解聚。同时，多种神经营养因子比如NGF,BDNF,NT-3,NT-4/5和NT-6，的表达水平开始上调。华勒变性的一个重要形态学特征就是雪旺氏细胞柱(Colum ns of Schw ann cells)的形成，这些结构将引导未来轴突再生的方向。事实上，在再生发生时，轴突将沿着雪旺氏细胞柱产生比原来更多的分叉和突起[8]。然而，在再生过程中，并非所有的突起都会保存下来，只有那些和所支配组织建立了功能联系的突起得到保留，而未建立联系的将会发生变性而消失。

近年来，用胶质细胞移植来重建外周神经获得越来越多的关注，其中雪旺氏细胞移植是最有希望的一种方法。因为雪旺氏细胞可以分泌多种神经营养因子，并包绕再生的轴突形成髓鞘。外周神经受损伤后，雪旺氏细胞和巨噬细胞可以清除坏死组织和髓鞘碎片，并增殖形成雪旺氏细胞柱[9]，雪旺氏细胞通过表达细胞黏附因子和形成神经内膜鞘，从而给神经再生创造了一个有利的环境，引导着轴突向着其原来支配组织的方向延伸。

Mosahebi等发现，雪旺氏细胞移植同时提高了轴突再生的质量和速度。然而，由于扩增足够数量的雪旺氏细胞需要比较长的时间(大约10周)，因此，急性病例的自体移植似乎不现实。另外在纯化雪旺氏细胞时常常会受到上皮细胞的污染[10]。为了更好地纯化雪旺氏细胞，可以在培养基中加入阿糖胞苷来抑制上皮细胞的增殖，并使用一种特殊的细胞分离技术，通过上述改进，可以在10天内得到纯度高达99.2%的雪旺氏细胞[11]。

因为培养体系只能生产数量有限的胶质细胞，这成为临床应用的一个障碍。由于干细胞自身大量增殖的特性，因此非常适合大量制造可用于临床的细胞。神经干细胞NSCs具有分化为胶质细胞的潜能，因此也可以用于胶质细胞的移植。Murakam i等将移植有神经干细胞的硅胶管用于大鼠的神经损伤治疗，结果发现神经干细胞促进了轴突再生。尽管使用未分化的神经干细胞在实验中表现良好，但需要注意的是肿瘤形成的风险，因此需要在移植前仔细确定干细胞的特性，以避免亚克隆的产生，而亚克隆可以转变为肿瘤[12]。

间充质干细胞(MesenchymalStem Cells,MSCs)是另一种有广泛临床应用前景的干细胞。获得间充质细胞的来源比较广泛，比如骨，脂肪组织，脐带血和牙髓，而且纯化和扩增相对简单。间充质细胞可以分化为多种组织，比如成骨细胞,软骨细胞,生肌细胞，脂肪细胞以及神经样，胶质样细胞。雪旺氏细胞也可以经由间充质干细胞分化而来，这些细胞在形态上，分子和功能特性上和雪旺氏细胞非常接近[13]。这条技术路线可能具有重要的临床意义，因为我们可以从病人身上得到大量的自体雪旺氏细胞，并应用于临床治疗。另外，已有证据显示大鼠脂肪来源的间充质细胞可以在神经再生过程中形成髓鞘。

通过基因工程方法使移植细胞表达特定的促进再生的因子，从而使得移植部位形成更好的再生环境。已有实验表明，当把表达大量FGF-2分子的雪旺氏细胞移植到损伤部位时，大鼠外周神经再生的长度和数量都增加了[14]。

3.2鲁菲尼氏神经末梢的再生 迄今，我们仍然对拔牙和损伤导致的牙周鲁菲尼氏神经末梢的再生过程知之不多。为数不多的研究集中于啮齿类动物门牙的舌侧牙周膜(lingual periodontal ligament)，因为这个部位有丰富的鲁菲尼神经末梢分布。这个部位的牙周膜分为三个部分，第一部分是牙槽相关部分(alveolus-related part，ARP)，第二是牙齿相关部分(tooth-related part，TRP)，第三部分是断层带(shear zone)[15]。

下牙槽神经切断后第三天，牙周膜牙槽相关部分中神经纤维的完全丧失，但是末梢雪旺氏细胞没有任何改变。第5到7天时，该位置出现PGP9.5免疫阳性神经末梢并逐步增加，而且其末端分叉也越来越多。在这个阶段，S-100免疫阳性的纺锤样细胞开始在牙齿部分和断层带中出现并逐步增加，这些细胞内部有丰富的的横纹样结构，这种结构在形态上和纤维样长间隔胶原(fibrous long-spacing collagen)很接近。已有报道证实这些横纹结构存在于末梢雪旺氏细胞的胞体内[16]，提示这些纺锤样细胞可能是末梢雪旺氏细胞。第10到14d时，再生的鲁菲尼氏神经末梢数量仍然比较少，且沿着断层带和牙槽部分的长轴方向分布。牙齿部的纺锤样细胞数量略微减少，并在断层带互相融合呈现盘状结构(cord-like appearance)。第14到21d时，再生的鲁菲尼氏神经末梢几乎恢复到正常水平，S-100免疫阳性的纺锤样细胞则逐步减少并消失。

3.3鲁菲尼氏神经末梢的再生过程中的生物活性物质变化

3.3.1神经肽(Yneuropeptide Y) 在生理状态下，牙周膜周围的鲁菲尼氏神经末梢并无神经肽Y的表达，因为这种神经肽主要表达于交感神经系统而非感觉神经系统。但外周神经损伤后牙周膜鲁菲尼氏神经末梢神经肽Y的水平出现一过性升高，在感觉神经节以及脊髓后角也出现了升高。下牙槽神经受损也可以导致神经肽Y了在轴突以及末端鲁菲尼末梢表达水平的升高，同时三叉神经节和中脑三叉神经核的神经元内的表达水平也升高[17]。

因为神经肽Y的神经营养作用，因此推测损伤导致的水平升高可能和神经再生有关。同时神经肽Y养也可能和损伤后导致的感觉异常有关系，比如机械性痛觉过敏和伤害感受[18]。

3.3.2生长相关蛋白43(Grow th-associated protein-43，GAP-43) 生长相关蛋白43是一种关键的和轴突生长和突触形成相关的膜结合蛋白。这种蛋白广泛分布于发育和再生中的神经元并在轴突生长过程中被运输到轴突生长末端。其表达水平在再生中的神经元以及轴突可塑性活跃的脑区比如海马，嗅球等部位升高[19]。

大鼠门齿的牙周膜鲁菲尼末梢在生理条件下有生长相关蛋白的表达，这种表达局限于包绕鲁菲尼末梢的雪旺氏细胞鞘上，而不在胞体和轴突上。下牙槽神经切断后，生长相关蛋白在末梢雪旺氏细胞的胞体和以及牙周膜鲁菲尼末梢上出现一过性升高。而且，纺锤型雪旺氏细胞上也出现高表达。这些结果提示，这种蛋白参与了牙周膜轴突末梢和末梢胶质细胞的的再生[20]。

3.3.3钙结合蛋白(Calcium Binding Proteins)

钙结合蛋白属于一个蛋白家族，他们可以和钙离子发生紧密结合并通过改变细胞内钙浓度而参与神经递质释放和突触可塑性等活动。他们可以按功能分为两类，一类可以缓冲钙离子，比如Parvalbum in和Calbindin D28，他们通过参与缓冲细胞内钙离子起作用。另一类可以激发钙离子，比如Calmodulin，他可以结合钙离子进而改变自身的空间结构而触发酶或离子通道。已有实验证实在背根神经节有Parvalbum in和Calbindin D28k的表达，这提示他们可能参与机械感受活动。另外在三叉神经节也有钙结合蛋白的表达[21]。

免疫组化证据表明，在大鼠门牙牙周膜鲁菲尼末梢上有Parvalbum in和Calbindin D28k的表达，但在牙周膜的自由末端上并无表达[22]。目前尚不清除钙结合蛋白在牙周膜鲁菲尼末梢上所起的作用。但机械刺激可以导致钙流入皮肤机械感受器的轴突末梢，而且皮肤机械感受器的轴膜上有高密度的钙－ATP酶。这提示钙结合蛋白可能和机械感受器内钙水平的稳定有关。下牙槽神经切断后56天， Calretinin和Calbindin D28k免疫阳性鲁菲尼末梢数量才恢复正常，然而，鲁菲尼末梢的再生在第28天即已完成，这提示功能意义上的再生要晚于形态上观察到的再生[23]。

3.3.4 神经营养因子受体(Neurotrophin Receptors) 神经营养因子包括神经生长因子(Nerve Grow th Factor，NGF),脑源性神经生长因子(Brain-Derived Neurotrophic Factor，BDNF),神经营养因子3(Neurotroph in-3，NT-3),神经营养因子4/5(NT-4/5)和神经营养因子6(NT-6)。这些因子要通过和特定神经因子受体结合而起作用。神经因子受体可分为两大类，一类是低结合受体，如p75 NGF受体(p75-NGFR)，这类受体可以与几乎所有的神经营养因子结合。而高结合受体则与特定神经营养因子结合，比如Trk A可以和NGF结合,Trk B可以和BDNF和NT-4/5,而Trk C可以和NT-3结合，同时，NT-3 Trk A以及Trk B结合[24]。

成熟的牙周膜组织上可以在自由末端轴突，鲁菲尼末端的轴突膜以及末梢雪旺细胞的阿胞膜上观察到p75-NGFR免疫阳性。在大鼠门牙牙周膜的再生中，可以观察牙龈部分末梢雪旺氏细胞和断层带和牙齿部移行雪旺氏细胞上的p75-NGFR免疫阳性。Trk B可以在某些牙周膜鲁菲尼末端上可以看到，然而并非所有的牙周膜鲁菲尼末端表达Trk B。同时，某些雪旺氏细胞也表达Trk B。BDNF和Trk B基因敲除的动物，其皮肤内鲁菲尼末梢降到很低的水平[25]，这提示BDNF/Trk B信号参与了皮肤鲁菲尼末梢的发育。由此推测BDNF/Trk B信号可能也参与了牙周膜鲁菲尼末梢的再生。Trk B和Trk C受体则未见于在牙周膜的表达。

3.4牙周膜的重建 牙周膜是牙齿感受机械刺激最重要的组织，而且起到支持和保护牙齿的作用。在拔除牙齿后，牙周膜遭到破坏，即使种植体产生骨结合的部位，牙周膜也是缺失的。如果能在种植体周围重建牙周膜，那么，种植体将会受到牙周膜的保护，使骨结合更为牢固，骨感知更加灵敏，甚至接近天然牙的水平，从而在很大程度上提高患者的生活质量。

早期的重建牙周膜的研究工作试图将牙根骨质去矿物质化，从而暴露其下的胶原纤维，进而和新生的胶原纤维整合在一起。但这种操作会引起强直(anky losis)和牙根重吸收，从而导致重建失败。另外一种策略是在牙周损伤部位移植骨移植物，这种移植虽然可以增加牙周组织的结合程度，但缺乏骨诱导作用，形成的主要是致密纤维组织而不是有序的牙周膜组织[26]。

近年来，引导型组织再生成为重建牙周组织的常用手段，这种策略将损伤部位和毗邻牙槽骨用生物膜隔离开来，从而阻止上皮组织和牙龈结缔组织浸润到损伤部位，同时促进来自牙周膜组织的细胞迁移。这种策略的进一步改进包括了移植高表达某些外源性促生长因子。常用的分子有骨形成蛋白(Bonemorphogenetic proteins)血小板源性生长因子(Platelet derived grow th factor),釉基质蛋白(Em dogain)以及重组釉原蛋白(Recombinant amelogenin protein)。这些因子可能通过吸引间充质细胞并进一步分化为牙周组织来起作用。另外，表达骨形成蛋白和血小板源性生长因子牙周膜干细胞(Periodontal Ligament Stem Cells)移植后也产生了正常牙周组织[27]。

上述促进牙周组织重建的技术可用于来提高种植后骨整合以及提高骨感知的水平。然而由于种植后在种植体表面形成的是纤维组织而非功能性的骨质，已有动物实验证实，只有在种植体和残存牙根接触的部位才形成骨质样结构。而且，种植体周围纤维的附着的质量也是可疑的[28]。

有人设想将附着在种植体上的骨结构转变为骨质，然后在其周围移植牙周膜细胞，进而实现牙周组织的重建。这个策略首先在牙缺失部位种植种植体，3个月后，等骨整合完成，将这个种植体连同周围的骨组织取出，然后将体外扩增的牙周膜细胞移植入此空腔，接着将附着有釉基质蛋白的种植体重新放置回空腔内，经适度负重后，种植体周围骨结构有望转变为细胞为基础的骨质，而牙周膜细胞有望转变为完整的有功能的牙周结构，从而在最大程度上模拟天然牙[29]。

4.结语

迄今为止，骨感知机制的研究主要集中于移植体周围形态学观察，电生理评估和皮层高级功能整合的观察，对于如何提高骨感知的水平，以使其达到或接近天然牙的水平，从而提高患者的生活质量则少有讨论。近年来，神经再生领域和组织工程领域取得重要进展，因此有必要将这些进展引入骨感知研究和临床应用。间充质干细胞可以诱导为雪旺氏细胞或者其前体细胞，这些细胞移植到种植体周围可以促进种植体周围的神经再生，从而重建向中脑和皮层的感觉投射，这将有利于骨感知的建立和维持以及提高骨感知的水平。

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