上皮性卵巢癌中FHIT和Bax的表达状况及临床价值

刘云春 舒丽莎 于秀梅

卵巢癌是妇科肿瘤中病死率最高的恶性肿瘤，由于肿瘤的发生发展与细胞的凋亡、抑癌基因的失活关系密切，FHIT和Bax基因在促进细胞凋亡中发挥重要作用。本研究通过检测卵巢肿瘤组织中FHIT和Bax蛋白的表达状况，分析它们与上皮性卵巢癌临床分期、病理类型、病理组织分级、淋巴转移等临床病理诸特征的关系，探讨其在肿瘤发生发展中的作用和关系，了解其在卵巢癌预后方面的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集河北北方学院附属第一医院妇产科住院并经手术治疗的原发性的上皮性卵巢癌患者材料，选择病历资料完整者共50例，患者年龄21～76岁，平均年龄(54±12)岁，经手术病理检查确诊，其中病理类型:卵巢浆液性癌30例，粘液性癌14例，子宫内膜样癌4例，透明细胞癌2例;病理分化程度:高分化 32例，中低分化 18例;手术病理分期［按国际妇产科联盟(FIGO)2000年手术病理分期标准］:Ⅰ期和Ⅱ期16例，Ⅲ期和Ⅳ期34例;盆腔淋巴结有转移者16例，无转移者34例。选择同期卵巢良性卵巢肿瘤20例及卵巢交界性肿瘤15例作为参照。

1.2 免疫组化分析 采用免疫组织化学SP法，一抗为兔抗人FHIT蛋白多克隆抗体，鼠抗人Bax多克隆抗体，稀释1∶50为工作浓度。SP试剂盒和二氨基联苯胺(DAB)为北京中山生物技术公司产品。手术标本均经10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，3 μm厚连续切片，贴于涂有多聚赖氨酸的载玻片上。切片染色前常规脱蜡、水化，修复抗原，0.3%H2O2溶液阻断内源性的过氧化物酶，全部操作过程按SP试剂盒说明书操作规程完成。用已知的阳性切片作为阳性对照，用磷酸盐(PBS)缓冲液代替一抗作为阴性参照。

1.3 染色特征及结果判定标准 FHIT和Bax的染色定位于肿瘤细胞浆中，以细胞浆中出现棕黄色颗粒视为阳性细胞，参照Connlly等的方法，染色结果判定的标准是根据染色的强度和阳性细胞百分数综合评分:(1)染色强度:无着色是0分;淡黄色是1分;棕黄色为2分;棕褐色为3分;(2)阳性细胞百分数:＜10%为0分;10% ～50%为1分;50% ～75%为2分;＞75%为3分。FHIT和Bax最终的评定结果为染色强度和阳性细胞百分数的乘积，1～2分为阴性，3～9分为阳性。

1.4 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，计数资料比较采用χ2检验和确切概率法(Fisher’s exact test)，FHIT和Bax蛋白的相关性采用Speaman等级相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FHIT和Bax在卵巢上皮性肿瘤中的表达 FHIT蛋白在良性组和交界性组中均阳性表达，癌症组中的阳性率降低为72%，明显低于良性组和交界性组(χ2=11.732，P ＜0.05);Bax主要表达在卵巢上皮(或癌细胞)的胞浆，间质偶有表达。3组Bax的表达依次增加，但差异无统计学意义(χ2=5.066，P＞0.05)。见表1。

表1 不同组织中FHIT和Bax的表达 例

2.2 病理分期与FHIT和Bax的表达 卵巢癌组病理分期Ⅰ/Ⅱ期和Ⅲ/Ⅳ期FHIT阳性表达率分别为75%和70.58%，2组比较差异无统计学意义(P＞0.05);卵巢癌组病理分期Ⅰ/Ⅱ期和Ⅲ/Ⅳ期Bax阳性表达率分别为43.75%和38.23%，2组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表2 病理分期与FHIT和Bax的表达 例

2.3 病理类型与FHIT和Bax的表达 3组FHIT、Bax阳性表达率接近，差异无统计学意义(P＞0.05)。见表3。

2.4 分化程度与FHIT和Bax的表达 在高分化、中低分化卵巢癌组织中FHIT阳性表达率分别为81.25%和55.55%，2组比较差异有统计学意义(P＜0.05)在高分化、中低分化卵巢癌组织中Bax阳性表达率分别为50.00%和22.22%，2组比较差异有统计学意义(P ＜0.05)。见表4。

表3 病理类型与FHIT和Bax的表达 例

表4 分化程度与FHIT和Bax的表达 例

2.5 淋巴结转移与FHIT和Bax的表达 在淋巴结有转移组和无转移组的卵巢癌组织中FHIT阳性表达率分别为82.35%和50%，2组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。在淋巴结有转移组和无转移组的卵巢癌组织中Bax阳性表达率分别为38.23%和43.75%，2组比较差异无统计学意义(P ＞0.05)。见表5。

表5 淋巴结转移与FHIT和Bax的表达 例

2.6 卵巢癌组织中FHIT和Bax表达的相关性 50例卵巢癌组织中FHIT和Bax表达的关系，进行spearman相关分析显示，FHIT和Bax表达呈正相关(r=0.400，P ＜0.01)。见表6。

表6 卵巢癌组织中FHIT和Bax相关性 例

3 讨论

3.1 FHIT的表达与上皮性卵巢癌的关系 Buttitta等［1］对54例早期卵巢癌研究发现，4%(2/54)FHIT基因出现异常转录，15%(8/54)有等位基因的缺失，22%(12/54)有乳腺癌和(或)卵巢癌家族史的年轻患者，这些病例无FHIT基因的改变。结果表明，FHIT在卵巢癌的发生中起一定的作用。另一项卵巢癌研究发现，晚期癌中位于染色体3p14的FHIT位点的LOH频率显著增高，提示FHIT与晚期卵巢癌有关。Manderson等［2］报道一些上皮性卵巢癌标本中3号染色体短臂(3p)有三个最小区域的缺失，提示FHIT基因的失活可能对卵巢癌的发生有重要作用。Mandai等［3］研究发现39%的卵巢癌和83%的交界性卵巢肿瘤标本同时出现正常和异常的FHIT转录，8%(4/51)的卵巢癌标本其FHIT转录缺失且均为Ⅲ～Ⅳ期的低分化晚期卵巢癌病例，而在良性卵巢肿瘤和正常卵巢组织中FHIT转录未见异常。Ozaki等［4］用免疫组化分析了44例卵巢癌、19例交界性癌和16例良性腺瘤的FHIT的表达:14%(6/44)的卵巢癌标本中FHIT蛋白表达降低或缺失，但在交界性和良性肿瘤中均蛋白表达;蛋白表达的缺失与FHIT基因转录缺失密切相关，也都发生在晚期(Ⅲ～Ⅳ期)腺癌病例中。这些研究提示FHIT基因的转录和表达异常可能是卵巢恶性肿瘤，特别是晚期肿瘤的一个重要标志，FHIT表达缺失或降低是卵巢癌发生的重要遗传学事件。

本试验主要研究FHIT在上皮性卵巢癌中的表达情况，发现28%的卵巢癌FHIT蛋白表达降低或缺失，表达较良性卵巢上皮性肿瘤和交界性卵巢上皮性肿瘤明显降低(P＜0.05);但在良性上皮肿瘤和交界性卵巢上皮性肿瘤中的表达无明显的差异(P＞0.05)。本试验进一步研究发现FHIT的表达与病理分级和淋巴结转移关系密切(P＜0.05)，FHIT蛋白的低表达主要见于低分化癌和有淋巴结转移者，提示FHIT与卵巢癌的恶性生物学行为密切相关，在卵巢癌的发生发展中起重要作用，其异常表达与卵巢癌的预后有关。

3.2 Bax的表达与上皮性卵巢癌的关系 Schuyer等［5］报道Bax表达与卵巢癌自然发展过程(相对危险系数0.44，P=0.05)和总生存率(相对危险系数 0.42，P=0.03)有联系。Bax的表达可能成为卵巢癌患者的一个预测指标。Shigemasa等［6］用半定量PCR技术测定Bax在卵巢肿瘤及腺癌中表达明显高于卵巢正常组织(P＜0.05)。生存分析表明Bax mRNA的低表达与卵巢癌Ⅲ期患者的低生存密切相关(P=0.05)。Kupryjanczyk等［7］研究表明，Bax表达与 PR水平相关(P ＜0.0189)，而与ER无关，说明Bax蛋白调节有一定的组织特异性。Bax可随卵巢黄体周期而改变，在月经中期及妊娠早期无表达，而在退化黄体中有表达，提示Bax通过控制凋亡在人类黄体寿命中期重要作用。当妊娠后，hCG可通过降低Bax的表达来延长黄体寿命。Skirnisdottir等［8］报道，Bax的阳性表达与年龄相关(P=0.012)，提示更好的生存率。多变量回归分析表明，肿瘤分级(P=0.0006)和 Bax的表达(P=0.020)是独立和有意义的预后指标。

本实验研究发现:从良性到恶性卵巢上皮性肿瘤Bax均有表达，但差异无统计学意义(P＞0.05)。卵巢上皮性癌中Bax的阳性表达只与组织分化程度有关，Bax的阳性表达率与年龄、FIGO分期、病理类型、残余灶大小、淋巴结转移不相关(P＞0.05)。谭毅等［9］也发现卵巢上皮性肿瘤中有 Bax的表达，但差异无统计学意义(P＞0.05);Bax在不同组织分化的卵巢癌中的表达有显著差异，组织分化越好，Bax的表达率越高。而谭毅等［9］报道，Bax在卵巢癌中的表达与病理分级成正比，与我们的结果不同。以上检测结果的不同，可能是受样本例数、检测对象和实验方法的灵敏度等的影响，故可通过通过扩大样本和改进方法等来进一步研究。

3.3 上皮性卵巢癌中FHIT和Bax的相关性 在上皮性卵巢癌中FHIT和Bax的相关性鲜见报道。本试验探讨FHIT和Bax在皮性卵巢癌发生发展中的相互关系，发现FHIT和Bax的表达成正相关(r=0.400，P ＜0.01)。因为 FHIT、Bax 参与了细胞凋亡的调节。所以FHIT和Bax在卵巢肿瘤形成和发展中是相辅相成的关系。

卵巢上皮性肿瘤的发生需要多个癌蛋白的参与，这些癌蛋白可诱导瘤细胞的增生、分化、转移及肿瘤血管的形成。FHIT可能通过参与凋亡的调节，抑制卵巢上皮肿瘤的形成及恶性进展。本试验发现卵巢上皮性癌中的FHIT表达缺失高于卵巢良性或交界性肿瘤，而且卵巢上皮性癌中FHIT表达随组织分化及淋巴结转移差异有统计学意义(P＜0.05)。实验还同时发现Bax也参与了卵巢上皮性肿瘤的发生发展。所以FHIT和Bax在卵巢上皮性肿瘤的发生发展中具有重要意义。

卵巢癌的化疗是卵巢癌治疗的重要手段，研究表明，许多化疗药物均能不同程度地诱导凋亡，肿瘤细胞凋亡敏感性可能是影响化疗效果的关键因素［10］，因此，能否诱导凋亡已成为筛选抗癌药物的标准之一，如何诱导凋亡也成为新的化疗目标。

癌基因的异常表达或抑癌基因的表达缺失导致肿瘤对传统治疗方案敏感性下降，由此带来肿瘤的进展和疗效的下降。新的基因治疗是通过基因传递恢复肿瘤细胞对传统治疗的反应性。因此，促凋亡基因家族成员Bax可以成为肿瘤细胞传统化疗和放射治疗的增敏剂。有研究表明，当放疗联合Ad/Bax比单独放疗或Ad/Bax显著增加了卵巢癌细胞的死亡，此外，与Bax调节细胞死亡相一致的是放疗联合Ad/Bax可明显的观察到卵巢癌细胞的凋亡［11］。

1 Buttitta F，Marchetti A，Radi O，et al.Evaluation of FHIT gene alterations in ovarian cancer.Br J Cancer，1998，77:1048-1054.

2 Manderson EN，Presneau N，Provencher D，et al.Comparative analysis of loss of heterozygosity of specific chromosome 3，13，17，and X loci and Tp53 mutations in human epithelial ovarian cancer.Mol Carcinog，2008，34:78-90.

3 Mandai M，Konishi I，Kuroda H，et al.Expression of abnormal ranscripts of the FHIT(fragile histidine triad)gene in ovarian carcinoma.Eur J Cancer，1998，34:745-749.

4 Ozaki K，Enomoto T，Yoshino K，et al.Impaire FHIT expression characterizes serous ovarian carcinoma.Br J Cancer，2001，85:247-254.

5 Schuyer M，Vander Burg MF，Henzen Logrnans SC，et al.Reduced expression of bax is associated with poor prognosis in patients with epithelial ovarian cancer:a multifactorial analysis of TP53，p21，Bax and Bcl-2.Br J Cancer，2001，85:1359-1367.

6 Shigenmasa K，Katoh O，Shiroyama Y，et al.Increased MCL-1 Expression is associated with poor prognosis in ovarian carcinomas.Jpn J Cancer Res，2002，93:249-253.

7 Kupryjanczyk J，Dansonka Mieszkowska A，Szymanska T，et al.Spontaneous apoptosis in ovarian carcinoma:a positive association with p53 gene mutation is dependent on growth fraction.Br J Cancer，2000，82:579-583.

8 Skirnisdottir I，Sorbe B，Seidal T，et al.P53，bcl-2，and bax:their relations hip and effect on prognosis in early stage epithelial ovarian carcinoma.Int J Gynecol Cancer，2001，11:147-158.

9 谭毅，张晓化，将友义.抗凋亡基因bcl-2和bax与卵巢上皮性肿瘤的关系.现代妇产科进展，1997，6:19-21.

10 Ckman JA.Apoptosis and chemotherapy resistance.Eur J Cancer，1996，32:921.

11 Arafat WO，Gomez-Navarro J，Xiang J，et al.An adenovirua encoding proapototic Bax induces apoptosis and enhances the radiation effect in human ovarian cancer.Molecular Therapy Res，2006，6:545-554.