三角帆蚌人工感染细菌性疾病的组织病理学观察

王 伟，蒋 帧，钱国英，陈吉刚

(浙江省重中之重学科实验室 浙江万里学院生物与环境学院，浙江 宁波 315100)

三角帆蚌 (Hyriopsis cuminglii)又称河蚌、三角蚌、珍珠蚌，隶属于瓣鳃纲 (Lamellibrachia)、真 瓣 鳃 目 (Eulamellibranchia)、 珠 蚌 科(Uionidae)、帆蚌属 (Hyriopsis)，是广泛分布于我国淡水湖泊等水域的大型双壳类底栖动物，也是我国特有的优质淡水珍珠蚌。因该蚌贝壳外形略呈不等边三角形，背缘向上伸展成三角帆状，故名三角帆蚌［1］。多年来，三角帆蚌的蚌病一直是制约淡水珍珠养殖发展的瓶颈问题之一，严重时大范围内频繁发生。近年来，我国南方各省三角帆蚌养殖发展势头迅猛，三角帆蚌病害也呈现逐年增多的趋势，造成三角帆蚌大批死亡，给三角帆蚌养殖户带来了巨大的经济损失。

自1982年国内首次报道了三角帆蚌疾病病例并分离到点状产气单胞菌后［2］，科学家们才陆续开展了三角帆蚌死亡原因分析、疾病防治及流行规律等方面的研究。但关于三角帆蚌组织病理的相关研究和报道尚比较缺乏。刘巧林等［3］运用光学显微镜和电子显微镜观察了三角帆蚌感染瘟病后外套膜、鳃和斧足的病理变化特征。最近，钟蕾等［4］报道了人工感染三角帆蚌病毒性疾病的组织病理学结果，发现消化腺、胃、肠、外套膜、斧足和鳃等均出现大量细胞空泡化、肿大，为病毒损害的主要靶器官。本课题组在前期三角帆蚌流行病学调查中采集到典型症状的病蚌，分离鉴定出其细菌性病原，并以此用人工方法感染健康三角帆蚌，探讨该细菌病对三角帆蚌主要组织器官的影响，旨在为三角帆蚌的病害防治研究提供理论基础，现将相关结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

育珠三角帆蚌10只取自绍兴大阪南大江养殖场，3龄，平均体长16.9 cm，饲养在浙江万里学院水生生物健康养殖试验室水族箱中，恒温 (25±0.5)℃，饲养1周确认无病菌后进行人工感染试验。三角帆蚌活病体同样采集于绍兴大阪南大江养殖场，为1～3龄。

1.2 人工感染

从具有明显症状的蚌的病灶组织分离到4株优势细菌，进行培养接种。试验组注射细菌浓度为8.6×108mL-1，对照组注射的是0.01 mol·L-1的PBS缓冲液。注射总剂量为1 mL，从斧足多次点状注射，注射深度为 0.5～1.0 cm。注射后置(25±0.5)℃水中饲养。

每天观察并记录试验蚌的发病情况和死亡情况，以吐水无力、分泌大量粘液和闭壳肌收缩无力作为病蚌的判断标准。

1.3 病蚌组织的采集

对发病蚌仔细观察，确认具有典型病症后取样。分别采集病蚌和健康蚌的内脏团、肠道、闭壳肌、外套膜、鳃、斧足和直肠组织，以健康蚌的相应部位组织作为对照样品。采集的样品迅速投入4%甲醛溶液固定24 h。

1.4 石蜡切片制作

以常规石蜡切片程序进行脱水、透蜡、包埋，切片厚度8μm，经常规HE染色后在显微成像系统下进行观察和拍照。

2 结果和分析

2.1 临床症状

三角帆蚌病蚌体内有大量粘液排出，双壳微微张开，斧足紧缩不伸展。解剖显示，健康蚌的鳃颜色为暗黄色，而病蚌鳃组织呈褐色;健康蚌斧足和外套膜为乳白色，而病蚌的颜色为黄色;病蚌肠道有不同程度的肿大和腹水。健康和患病珍珠蚌临床症状观察结果见图1。

图1 健康和患病三角帆蚌的临床症状比较

2.2 组织病理变化

闭壳肌。与健康蚌的闭壳肌组织相比，患病个体的闭壳肌纤维略显膨大，细胞之间的距离较大，且肌纤维弯曲程度小 (图2)。这些结果的原因可能是由于一些死亡的细胞由于骨架结构的变化而造成的。

图2 健康和患病三角帆蚌的闭壳肌组织学比较

肠道。健康蚌的肠道中含有大量空泡结构，这些结构连结成片;而在患病个体肠道组织中空泡结构小而稀疏 (图3)。

此外，与健康蚌相比，患病个体肠道外围柱状上皮较健康个体细胞核细长，这可能代表了细胞不同的分化状态。

图3 健康和患病三角帆蚌的肠道组织学比较

外套膜。健康个体的外套膜细胞联系紧密，组织中间是疏松连接的组织，中间有多个空泡;而患病个体的外套膜内部细胞已丧失细胞形态，几乎与外周上皮细胞没有联系 (图4)。

图4 健康和患病三角帆蚌的外套膜组织学比较

肝脏。图5结果可以看出，健康个体的肝脏细胞排列整齐，管状组织外围细胞排列整齐;而患者肝脏管状组织外围细胞排列不整齐，细胞核深染，细胞连接松散。

鳃。健康个体的鳃组织细胞排列致密，细胞核形态为长梭形;而患病个体的鳃组织细胞排列疏松，细胞核形态为长圆形 (图6)。

直肠和斧足。健康蚌直肠上皮由单层柱状纤毛上皮细胞和少量杯状细胞组成，与患病个体的直肠组织学没有明显差异 (图7)。

从图8可以看出，斧足组织学也没有发现明显差异。

图5 健康和患病三角帆蚌的肝脏组织学比较

图6 健康和患病三角帆蚌的鳃组织学比较

图7 健康和患病三角帆蚌的直肠组织学比较

图8 健康和患病三角帆蚌的斧足组织学比较

3 小结与讨论

人们一致认为蚌病防治难，主要是蚌病临床诊断难，而病症观察、病蚌解剖及多种病理变化的比较是确诊蚌病的重要线索［5］。本试验对三角帆蚌人工感染细菌性疾病的病理变化进行了全面观察。临床病理变化主要表现为病蚌肠黏膜上皮细胞有不同程度的变性和坏死;内脏团细胞排列不整齐，细胞核深染;鳃组织糜烂，细胞排列疏松，明显的组织病理学改变可以为蚌病的有效诊断提供借鉴。

试验结果发现，内脏团 (肝脏)、肠道和鳃组织是三角帆蚌发病时的主要典型病变器官。这与已报道的三角帆蚌爆发细菌性疾病时的典型症状相符合［5-7］。文祝友等［6］曾报道，嗜水气单胞菌对三角帆蚌的肝脏破坏最严重，其次是鳃，使得鳃丝细胞排列松散，纤毛受到不同程度的破坏，再次是肠和斧足。向建国等［7］研究了三角帆蚌人工感染气单胞菌后病理组织的显微结构，也发现肝脏、肠道和鳃组织发生了明显的病理变化，其中鳃组织首先遭到破坏，呈现炎性水肿，肝组织发生严重变性、坏死。当三角帆蚌发病时，最明显的病理变化往往集中在肝脏上，说明肝脏是细菌或病毒侵染的靶器官。与三角帆蚌瘟病不同的是，有学者报道，瘟病引起的组织病理变化主要部位除了肝脏，还集中在病蚌的胃和直肠上［8］，这可能与三角帆蚌的发病类型及发病机理有关。我们认为，细菌性疾病首先破坏的是三角帆蚌的消化系统和消化功能，进而破坏呼吸系统直至窒息死亡。试验结果可以为生产上开展三角帆蚌细菌性疾病的防治提供重要依据。

［1］ 刘凌云，郑光美.普通动物学 ［M］.3版.北京:高等教育出版社，1997:220-221.

［2］ 倪达书，葛蕊芳，叶振荣.三角帆蚌疾病的初步研究 ［J］.淡水渔业，1982(5):41-42.

［3］ 刘巧林，许宝红，钟蕾，等.三角帆蚌瘟病组织病理学动态变化［J］.湖南农业大学学报:自然科学版，2009，35(4):406-411.

［4］ 钟蕾，肖调义，黄倢，等.人工感染三角帆蚌病毒性疾病的组织病理学观察 ［J］.水生生物学报，2011，35(4):666-671.

［5］ 张根芳，方爱萍.淡水育珠蚌疾病临床诊断若干重要问题的探讨 ［J］.淡水渔业，1999，29(5):10-13.

［6］ 文祝友，刘晓燕，金燮理，等.三角帆蚌嗜水气单胞菌病的病理研究 ［J］.湖南农业大学学报:自然科学版，2001，27(1):56-59.

［7］ 向建国，钟蕾，黄兴国.三角帆蚌细菌病病理组织的显微结构研究 ［J］.内陆水产，2009(1):50-53.

［8］ 邵健忠，项黎新，李亚南，等.三角帆蚌瘟病的组织病理研究 ［J］.水产学报，1995，19(1):1-7.