黔不同产地苗药黑骨藤的质量分析

王文春 李 江 杨 阳

(贵阳中医学院，贵州 贵阳 550002)

黑骨藤为萝藦科杠柳属植物黑龙骨Periploca forrestii Schltr.的干燥根或全株。主产于西南的贵州等地，该属植物全世界共12种，我国产4种，均为药用植物，主要分布在西南地区［1－3］。黑骨藤被贵州省药材标准收载的一种苗药，为贵州十大苗药之一，其全株入药，具有通经、活血、解毒、祛风的功效，主治风湿性关节炎、跌打损伤、胃痛、消化不良、闭经、痢疾等［3－6］，是民间广泛应用于治疗闭合性软组织损伤、风湿与类风湿等疾病的民族药［2－4］;有研究［7］表明苗药黑骨藤药效与黄酮含量在一定的范围内呈量效关系，黄酮含量越高，抗炎作用越明显。随着对黑骨藤研究的不断深入，特别是在风湿性关节炎、闭合性软组织损伤、风湿痹痛、腰椎骨质增生等方面的广泛应用，使其需求量逐年增大。为了评价黑骨藤质量的优劣，我们以槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷为指标，采用高效液相色谱法(HPLC)测定黑骨藤中槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷的含量，从而为全面评价黑骨藤药材质量提供参考依据，为合理开发利用黑骨藤药材资源提供基本资料。

1 仪器与试药

1.1 仪器：岛津LC－20AT高效液相色谱仪DAD紫外检测器、威玛龙色谱工作站、AE/240型电子天平(上海梅勒仪器有限公司)、AVY220型电子天平(日本岛津)、SK8210HP型超声波清洗机(上海科导仪器有限公司)。

1.2 试药：槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷对照品(天津马克生物技术有限公司)，黑骨藤药材分别采至贵州贵阳(乌当下坝、香纸沟)、兴义、安顺、凯里等地，并经贵阳中医学院药学院孙庆文老师鉴定为正品，阴干。甲醇(分析纯，95%)，甲醇(色谱纯，批号111663)，水(娃哈哈纯净水，批号121700)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件：Hypersil－C18色谱柱(4.6mm ×250mm，5μm) ，甲醇：水(33：67)为流动相，流速为 1mL/min－1，检测波长370nm，柱温25℃，进样量10μL。在上述色谱条件下槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷与其他组分分离度良好。

2.2 对照品溶液的制备：精密称取槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷对照品10.16mg，置50mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀;精密吸取该对照品液1mL至10mL量瓶中，加甲醇制成每1mL含0.02mg的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备：将药材粉碎，取本品中粉2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇溶液50mL，称定，加热回流提取2h，放冷，用甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液过0.45μm的微孔滤膜，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察：精密称取经减压干燥至恒重的槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷对照品1.27mg置10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1mL含槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷0.127mg的对照品液。精密吸取该对照品溶液 2，4，6，8，10，12μL，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，其结果见表1。以对照品的进样量X(μg)为横坐标，峰面积值Y为纵坐标，绘制标准曲线。求回归方程，看其线性关系是否良好。

经计算的槲皮素－3－o－α－L－吡喃阿拉伯糖苷的回归方程为：Y=1.0E+6X －21142，r=0.9999。实验结果表明：槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷在0.254～1.524μg有良好的线性关系。

图2 黑骨藤样品及对照品HPLC A.对照品 B.样品

2.4.2 精密度实验：精密吸取上述槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷对照品液10μL，按上述色谱条件，连续进样6次，测定峰面积，计算平均相对标准偏差，结果见表2。

表2 精密度试验结果(n=5)

实验结果表明：槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷RSD为2.97%，说明该方法及仪器具有良好的精密度。

2.4.3 稳定性试验：取同一批号样品 ，按供试品溶液的制备方法操作，分别于0，2，4，8，12，24 h精密吸取10μL进样，测得槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷峰面积。结果见表3。

表3 稳定性试验结果(n=6)

实验结果表明：槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷RSD为1.56%，说明样品至少在24小时内稳定。

2.4.4 重复性试验：取同一批号样品6份，分别制备供试液，测得槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷平均质量分数，其结果见表4。

表4 重复性试验结果(n=6)

实验结果表明：槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷RSD为0.07%，说明测量方法的重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验：采用加样回收法，取已知含量的样品，精密称定，分别精密加入一定量的槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按上述测定方法进行测定，计算回收率，其结果见表5。

加样回收率=(测得量—原有量)/加入量×100%

表5 加样回收率测定结果(n=6)

实验结果表明：RSD为1.51%，说明所建立的方法加样回收率较高，符合含量测定要求。

2.4.6 样品中槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷的含量测定：取5批药材样品，按照上述含量测定方法测定，测定结果，其结果见表6。

表6 含量测定结果(n=5)

实验结果表明：所采的5批黑骨藤药材中槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷的平均含量为0.2288mgμg－1，其中贵阳香纸沟黑骨藤中槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷含量最高，含量为0.2410mgμg－1;兴义黑骨藤中槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷含量最低，含量为 0.2195mgμg－1。

3 讨论与结论

3.1 色谱条件的选择

3.1.1 流动相的选择：黑骨藤中含有多种化学成分，如黄酮类、生物碱类、内酯类、三萜类等多种活性成分，成分较为复杂［8］，为色谱条件的筛选增加不少难度。我们在本实验研究中考查了甲醇－水、乙腈－水不同比例的流动相，以甲醇－水(33：67)作为流动相得到比较为满意的结果。

3.1.2 检测波长的选择：根据文献及用二极管阵列检测器从190～400nm进行光谱扫描，槲皮素3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷对照品在370 nm处有最大吸收，故选择370 nm为检测波长。

3.2 提取方法和条件的选择

3.2.1 提取方法的选择：方法学考察过程中，对超声处理、加热回流及冷浸的提取方法进行了比较试验，结果表明加热回流提取法效果优于其他两种方法，故选用加热回流法制备本实验用样品溶液。

3.2.2 提取溶剂的选择：根据槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷的溶解性选用甲醇、乙醇作为提取溶媒，进行选择，并对30%甲醇、50%甲醇、纯甲醇、无水乙醇、50% 乙醇进行了比较试验，结果表明提取溶媒为纯甲醇时干扰较少，效果优于其他溶剂提取，故选用提取溶媒为甲醇。

3.2.3 提取时间的选择：确定选用回流提取法，甲醇为提取溶媒后，分别又对回流1，1.5，2，2.5，3 h进行了比较试验，结果表明回流提取2 h即能较完全提取出黑骨藤中的槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷，故选用回流提取2 h为样品提取时间。

3.3 结论：采用本试验所建立的方法测定了5批不同产地黑骨藤药材中槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷的含量，结果平均含量为0.2288mgμg－1，最低为兴义产只有0.2195mgμg－1，最高为贵州贵阳市郊香纸沟产含量为0.2410mgμg－1，不同产地黑骨藤药材中槲皮素 －3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷的含量有明显差异;一般黑骨藤喜生于阴湿的灌木丛中，我们意外发现生长在水分较少的石岩缝隙中的黑骨藤虽长势欠佳，但内部质量较佳;为此，认为还需进一步探索。说明苗药黑骨藤质量受产地、环境、气候、光照等的影响。

［1］贵州省药品监督管理局.贵州省中药材、民族药材质量标准［M］.2003年版.贵阳：贵州科技出版社，2003：381.

［2］包骏，冉懋雄.贵州苗族医药研究与开发［M］.贵阳：贵州科技出版社，1999：188.

［3］国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草(苗药卷)［M］.贵阳：贵州科技出版社，2005：526.

［4］贵州植物志编辑委员会.贵州植物志(第四卷)［M］.成都：四川民族出版社，1989：493－509.

［5］江苏新医学院.中药大辞典［M］.上海：上海科学技术出版社，1986.

［6］贵州省中药材、民族药材质量标准［S］.贵阳：贵州科技出版社，2003.

［7］张 宏，景小楠，于树华，等.黑骨藤中总黄酮含量的测定［J］.四川师范大学学报(自然科学版)，2010，33(1)：93.

［8］王富花，郁建平.药用植物黑骨藤化学成分研究初报［J］.山地农业生物学报，2008，27(6)：560.