中华蜜蜂有王群与无王群工蜂上颚腺10-HDA含量比较

吴丽丽 黄少康 李三妹 蒋星宏

（福建农林大学蜂学学院，福州 350002）

反式-10-羟基-2-癸烯酸（10-HDA）是工蜂上颚腺的主要分泌物，也是王浆中最主要的不饱和脂肪酸之一[1]。它不仅是王浆的天然保鲜剂，而且是雌性蜜蜂幼虫级型发育过程中重要的调控因子[2]。由于上颚腺与级型发育的关系，很早就受到研究者的关注，对不同蜂种的蜂王、工蜂上颚腺中10-HDA的检测已有不少报道。如，Plettner et al.（1993）对西方蜜蜂（Apis mellifera）的无王群采集蜂、有王群工蜂、产卵工蜂等的上颚腺10-HDA进行比较，未发现它们的10-HDA含量上有显著差异[3]。Plettner （1997）对5种蜜蜂的蜂王和工蜂上颚腺中包括10-HDA在内的多种成分进行了检测，检测表明，采自加拿大的西方蜜蜂越冬工蜂10-HDA含量高达95±15µg，采自马来西亚的大蜜蜂（Apis dorsata）采集蜂的含量达56，从斯里兰卡Horana采集的东方蜜蜂（A. cerana）外勤工蜂中仅检测到0.8±0.2µg/bee，黑小蜜蜂（A.andreniformis）工蜂为3.2±0.5µg/bee，小蜜蜂（A.florea）工蜂为11±1µg/bee。说明不同蜂种间工蜂，蜂王及工蜂间上颚腺10-HDA[4]等内容物含量存在显著差异。

蜂王的存在是蜂群完整性与稳定性的标志，蜂王上颚腺分泌物具抑制工蜂体内咽侧体活性，进而延迟工蜂的出巢日龄的作用[5]。有王蜂中，工蜂各项活动秩序井然；一旦失王，蜂群生物学特性以及工蜂腺体分泌物会发生显著性变化，这在海角蜜蜂中表现得尤其明显，室内无王笼养的海角蜜蜂工蜂上颚腺分泌物会逐渐向蜂王方向转化，逐渐以9-ODA为主[6]。对无王和有王状态下小蜜蜂（A.florea）工蜂上颚腺10-HDA的检测显示，无王群工蜂平均含7.4µg/bee，有王群工蜂平均含10.1µg/bee，两者之间有显著差异[7]，说明蜂王的有无对工蜂上颚腺10-HDA有影响。与西方蜜蜂相比，中蜂（A.cerana cerana）是一种对失王状态更为敏感的蜂种，中蜂群失王后，群内出现产卵工蜂的时间常常比西方蜜蜂短，那么，无王后，中蜂工蜂上颚腺的分泌物是否也会有所变化？在此，在有无和无王状态下我们对中蜂工蜂上颚腺主要的分泌物10-HDA含量进行了测定和比较，结果发现无王群工蜂10-HDA的含量极显著高于有王群工蜂，现具体报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 中蜂群

中蜂由福建农林大学蜂学学院提供，每群群势为3～4足框。有王群9群，无王群7群。无王群失王1～2周，群内无子、无工蜂产卵现象。

1.1.2 主要仪器与试剂

LC-20A高效液相色谱仪（日本岛津）（色谱柱：4.6mm×250mm不锈钢柱，填充物不定形硅胶C18键合相，10μm）；SPD-M20A二极管阵列检测器（日本株式会社岛津制作所）；KQ-300VDE型双频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；SHB-III循环水式多用真空泵（北京博医康实验系统有限公司）；流动相过滤装置（津腾）。有机滤膜（0.45μm），一次性5ml针筒，10ml容量瓶，玻璃研磨器等。

甲醇（色谱纯，德国MECK集团有限公司）；无水乙醇，磷酸（优级纯GR），对羟基苯甲酸甲酯（分析纯，含量99.0%），由国药集团化学试剂有限公司生产；10-HDA标准品（纯度99.6%，湖北扬子江蜂业公司）。

1.2 方法

1.2.1 取样

2010年6月10日，分别在10群中蜂有王群的巢门口抓取回巢的外勤蜂，每箱抓取工蜂约100只。从失王1～2周的7群无子、无王群中，提脾，每群取工蜂约100只以上，于-80℃冷冻保存。

1.2.2 试液的配置

（1）10-HDA标准品储备液配制

称取干燥后的10-HDA标准品0.0305g，用无水乙醇溶解并移入50ml容量瓶中定容。此溶液每毫升含10-HDA 0.61mg。

（2）内标溶液配制

称取干燥过的对羟基苯甲酸甲酯0.1671g，加无水乙醇溶解并移入250ml容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀。此溶液每毫升含对羟基苯甲酸甲酯0.6684 mg。

（3）样品溶液制备

剪取同群10只工蜂头部，放入一研磨器中，加入少量甲醇研磨，用超声波清洗器超声5min促使其溶解。把研磨液移入已经加入1ml内标溶液的10毫升容量瓶中。研磨器润洗2～3遍，润洗后的液体也移入容量瓶内，最后加甲醇定容，超声40min后静置过夜。用0.45μm滤膜过滤，滤液即为一待测样本。每群制备5个样本，无王群与有王群待测样本均同法制备。

1.2.3 色谱方法学检测

（1）线性关系考察

精密量取10-HDA标准品储备液0.2、0.5、1.0、2.0、4.0至10.0ml容量瓶中。精密加入内标溶液1ml，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀。分别吸取10μl注入液相色谱仪，210nm测定。结果表明，10-HDA进样量（X）在0.122～2.44μg范围内与峰面积（Y）呈现良好的线性关系。回归方程Y=2×10-5X+1.0167，R2=0.9999。

（2）精密度试验

自动进样10-HDA标准品10μl，重复进样5次，测得10-HDA峰面积相对标准偏差（RSD）为0.6%（n=5），进样方法和仪器精密度良好。

（3）稳定性试验

精密吸取中蜂工蜂头部样品10μl进样分析，分别于1h、4h、8h、12h、24h时重复一次，测得10-HDA峰面积的RSD为1.2%，表明样品溶液在24h内稳定。

（4）加样回收率试验

准确称取已知10-HDA含量的样本，分别加入适量的10-HDA标准品，制备样品溶液，进样10μl，测得10-HDA的回收率均在95%以上。

1.2.4 样品10-HDA含量测定

取待测样品，按以下色谱条件进样测定。色谱柱：20RBAX Eclipse XDB-C18，（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-0.2%磷酸溶液（55：45）；流速：1.0mL/min；检测波长：210nm；进样量：10μl。

1.2.5 数据分析

根据标准曲线法对HPLC检测所得10-HDA的峰面积换算得到工蜂10-HDA的含量。用SPSS软件中Levene test进行方差齐性检验，对方差齐性数据用one-way ANOVA中的LSD法对进行多重显著性分析，对方差不齐的数据组用one-way ANOVA中Dunett T3法进行多重显著性分析。用t-test对无王群和有王群工蜂10-HDA的含量进行差异比较。

2 结果与分析

对中蜂有王群10群及无王群7群工蜂上颚腺10-HDA含量的检测结果见表1。有王群中，每只工蜂头部10-HDA的平均含量为2.75±1.05µg（N=50）。不同蜂群间工蜂上颚腺10-HDA含量方差不齐，存在显著差异（Levene test，P＝0.02＜0.05），故采用SPSS中unequal variance ANOVA的Dunett T3进行多重显著性检验，检验结果表明，1号群的10-HDA含量显著低于4、6、7号群（p＝0.014，0.006，0.02＜0.05）。7号群外勤蜂10-HDA含量。

平均含量高达4.76±0.41µg，显著高于1，2，3群（P=0.02，0.05，0.032≤0.05）。2，3，4，5，8，9，10号群间无显著差异（P＞0.05），说明多数有王群间采集蜂的10-HDA含量无显著差异，仅个别蜂群（1和7号群）含量存在差异。由于我们的样本未明确日龄，还不能完全排除这种差异由日龄差异引起的可能性。

无王群工蜂10-HDA的平均含量为5.47µg（N＝35），为有王群工蜂含量的2倍，极显著高于有王群工蜂（t-test，P＝0.000＜0.01）。因为无王群各群间数据方差齐性（Levene test，P=0.58＞0.05），故采用LSD法进行多重显著性差异比较，结果显示，无王群中1号群工蜂10HDA平均含量均极显著高于2至7群（P=0.004，0.000，0.001，0.000，0.000，0.000＜0.01），10-HDA平均含量达8.32µg，其余各群之间均无显著差异（P＞0.05）。

表1 中蜂有王群和无王群工蜂10-HDA含量比较

3 讨论

本试验中所选用的无王群均为群内无子（卵、幼虫、蛹），且无工蜂产卵现象，工蜂主要从事花蜜采集；有王群工蜂均为回巢的工蜂，主要从事的也是采集活动，它们都不需要承担育子的工作，上颚腺不需要为承担哺育幼虫而提供10-HDA，因此，蜂群对这些工蜂的功能需求可以认为是相近的，即两种样本之间的主要差异是有王与无王的差异。在有王状态下，蜂王上颚腺信息素对工蜂的生理和行为都具有显著的控制作用，能抑制工蜂上颚腺向蜂王方向转变，因此，我们认为，中蜂无王群工蜂10-HDA平均含量显著高于有王群工蜂的现象主要与蜂群的无王状态有关，即失无王状态导致中蜂群内工蜂的10-HDA含量显著上升，而这种变化的出现，可能是因为无王群中没有了蜂王上颚腺信息素抑制因子的存在，从而对工蜂咽侧体产生影响，进而影响保幼激素（JH）的分泌，再对上颚腺产生影响的调控途径完成。但本试验结果与小蜜蜂[7]中的报道现象不同，具体原因尚不清楚。因为本次没有对测试工蜂的日龄进行控制，所以仍有必要进一步研究加以验证，同时，搞清这种变化的内部生理机制有助于揭示10-HDA的调控机制。

[1] 徐响，孙丽萍，董捷. 蜂王浆中脂类脂肪酸组成的研究. 2009,30(14):213-214.

[2] Spannhoff A, Kim YK, Raynal NJ, et al. Histone deacetylase inhibitor activity in royal jelly might facilitate caste switching in bees. EMBO Rep. 2011,12 (3):238-43.

[3] Plettner E, Slessor K N, Winston M L, et al. Mandibular Gland Components and Ovarian Development as Measures of Caste Differentiation in the Honey Bee (Apis melliferaL.). J. Insect Physiol.1993, 39(3):235-240.

[4] Plettner E, Otis GW, Wimalaratne PDC. Species-and castedetermined mandibular gland signals in honeybees (Apis). Journal of Chemical, 1997, 23(2): 363-377.

[5] Pankiw T. , Huang Z.Y. , Winston M.L. , Robinson G.E. Queen mandibular gland pheromone influences worker honey bee. (Apis melliferaL.) foraging ontogeny and juvenile hormone titers. Journal of Insect Physiology. 1998,(44): 685-692.

[6] Simon U E, Moritz R F A, Crewe R M. The ontogenetic pattern of mandibular gland components in queenless worker bees(Apis mellifera capensisEsch). Journal of Insect Physiology. 2001, 47:735-738.

[7] Keeling CI, Slessor KN, Koeniger N, Koeniger G, Punchihewa PWK.Quantitative analysis of the mandibular gland components of the dwarf honey bee (Apis floreaFabricius). Apidologie. 2000,(31): 293-299.