PRP促进光老化人皮肤成纤维细胞胶原与透明质酸合成的研究

邓辰亮 常毅 万伟东 郑江红 屈悦 茅广宇 丁志 杨松林

PRP促进光老化人皮肤成纤维细胞胶原与透明质酸合成的研究

邓辰亮 常毅 万伟东 郑江红 屈悦 茅广宇 丁志 杨松林

目的 体外研究人皮肤成纤维细胞（HSFs）发生光老化时，富血小板血浆（PRP）对其合成胶原与透明质酸的影响。方法 使用紫外线（UVA）照射体外培养的原代人皮肤成纤维细胞，并检测光老化细胞的细胞增殖情况及细胞倍增时间。用含不同浓度PRP（10%、30%、50%）的培养液培养光老化细胞，正常培养的光老化细胞为阴性对照，原代人皮肤成纤维细胞为阳性对照。ELISA检测各组细胞外液中胶原蛋白与透明质酸含量。结果 经紫外线照射后，细胞增殖减弱，加入PRP后，伴随PRP浓度的增加，细胞倍增时间缩短；ELISA检测发现，经过UVA照射的成纤维细胞COL1、COL3及透明质酸合成量，显著低于正常培养的成纤维细胞（P<0.01）。在PRP作用后，成纤维细胞的COL1、COL3及透明质酸合成量均明显增加（P＜0.01）。结论 PRP能显著促进光老化人皮肤成纤维细胞胶原与透明质酸合成，可应用于皮肤抗衰老的研究。

富血小板血浆 光老化 皮肤成纤维细胞 胶原蛋白 透明质酸

紫外线（UV）照射导致皮肤发生光老化，临床表现为皮肤失水、松弛、皱纹增加以及弹性下降；组织学上则表现为皮肤胶原纤维、弹性纤维断裂，透明质酸（Hyaluronic acid，HA）含量减少。皮肤胶原蛋白及透明质酸由真皮层内的成纤维细胞合成[1]，探索促进成纤维细胞合成胶原蛋白及透明质酸的方法，有望成为对抗皮肤光老化的又一途径。

富血小板血浆（Platelet-rich plasma，PRP）是全血经分离后得到的血小板浓缩物，含有大量的生长因子，如血小板源性生长因子（PDGF）、胰岛素样生长因子（IGF）、转移生长因子－β（TGF-β）、表皮生长因子（EGF）和血管内皮细胞生长因子（VEGF）等[2-3]。这些生长因子都能促进正常的成纤维细胞合成胶原与透明质酸。然而，PRP对于光老化的人皮肤成纤维细胞合成胶原与透明质酸的促进作用，目前仍缺乏相关研究报道。

1 材料和方法

1.1 实验材料与仪器

胎牛血清 （上海洛神生物科技有限公司）；DMEM培养基（Gibico公司）；6孔培养板、96孔培养板、T75 细胞培养瓶（Corning 公司）；0.22 μm 一次性滤器（Millipore 公司）；ELISA 试剂盒（R&D systems公司）。

CO2恒温培养箱（Thermo Fisher公司）；超净工作台（苏州净化设备厂）；恒温水浴箱（上海精宏实验仪器厂）；离心机（上海安亭实验仪器厂）；高速低温离心机（Eppendorf公司）；UVA紫外灯（广东雪莱特光电科技股份有限公司）；紫外辐照计UV-A型（北京师范大学光电仪器厂）。

1.2 成纤维细胞培养

取整形外科上睑或下睑手术时切除的健康皮肤，供者年龄30～46岁（获知情同意）。皮肤标本采集后除去皮下脂肪并剪成3 mm宽的条形，以0.25%DispaseⅡ 4℃消化8～11 h，用眼科镊掀去表皮，保留真皮组织，PBS清洗真皮组织3次后剪碎，加入0.1%复合胶原酶，37℃消化4 h，通过100目无菌不锈钢纱网过滤，收集滤液，1 000 r/min离心10 min，去上清，用含10%胎牛血清的DMEM重悬，备用。

1.3 PRP的制备及稀释

用预先装有3.0 mL肝素钠的50 mL针筒，以18 G针头取供者全血（获知情同意）30 mL，注入6支塑料离心管，每管5 mL，以Aghallo法进行离心。分2次离心，第一次215 g离心10 min，吸取全部上清液至交界面下约3 mm，移至另一离心管，平衡后再次离心，第二次863 g离心10 min，离心管中液体分为两层，上层上清液为贫血小板血浆（Plateletpoor plasma），下层为血小板浓缩物（Platelet concentrate，PC）。吸取约3/4上清液弃掉，剩余约0.7 mL摇匀，即PRP。

1.4 成纤维细胞光老化实验

按每孔1×105个细胞的密度，接种于6孔板上。使用15 J/cm2的360 nm的UVA照射成纤维细胞，使细胞发生光老化。细胞被分为5组，即阳性对照组（正常培养的人皮肤成纤维细胞+PBS）、阴性对照组（UVA+PBS）、小剂量组（UVA+10%PRP）、中剂量组（UVA+30%PRP）、大剂量组（UVA+50%PRP）。 测量灯管与6孔板照射平面之间距离为15 cm，用紫外辐照计测量此平面UVA照射功率，测量前长波紫外灯预热30 min，待照射功率稳定后测得功率为19.7 mJ/s，照射时以PBS置换培养基，掀开盖子，在恒温水浴箱中将细胞暴露于UVA辐照装置下，照射距离为15 cm。照射前2 h加入PBS和不同浓度PRP各5 mL，培养板置入37℃恒温水浴箱中，照射后含10%小牛血清的DMEM换液，置入培养箱中继续培养，24 h后收样。分别于成纤维细胞培养后及照射后 12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h、108 h、120 h进行细胞计数。

1.5 细胞倍增时间测定

受以上剂量照射后的成纤维细胞在培养瓶中继续培养72 h后终止培养，计数每瓶中的细胞数，并按下式计算细胞倍增时间（TD）：TD=0.693(T2-T1)/ln(N2/N1)，TD是T1至T2时间内细胞的倍增时间，N2是在T2时间的细胞数，N1是在T1时间的细胞数。

1.6 ELISA分析测量透明质酸

收集各组分第7天的培养液进行COL1、COL3、HA的ELISA检测。按说明书加标准品，绘制标准曲线。将阴性、阳性对照组以及待检测样品按设计孔位加入96孔板，每孔100 μL。按说明书操作，除空白组外均加入50 μL的检测缓冲液。混匀，37℃恒温孵育30 min。孵育之后弃液，用缓冲液冲洗4次，每孔加入100 μL的有效酶。混匀后，加盖37℃孵育30 min。冲洗缓冲液将检测板清洗4次，每孔加入100 μL酶作用物。避光室温孵育5 min，加入50 μL的反应终止溶液终止反应。15 min内，在405 nm波长下观察吸光率。测出HA的浓度。

1.7 统计分析

SPSS 11.0统计软件进行t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 成纤维细胞生长动力学观察

原代成纤维细胞随培养时间延长，细胞增殖数增加。紫外线照射后，细胞增殖速度和最大增殖数均较未被照射的细胞显著降低（P<0.05）（图1）。

伴随PRP浓度的增加，细胞倍增时间有缩短的趋势。PRP浓度在30%和50%时，细胞倍增时间的缩短明显小于未添加PRP组（P<0.05）（图2）。

2.2 ELISA检测胶原蛋白及透明质酸含量

培养至第7天的成纤维细胞培养液ELISA分析发现，伴随PRP浓度增加，细胞合成的COL1、COL3与HA量有增加的趋势，当PRP使用浓度达到30%～50%时，COL1、COL3与HA的增加较PRP浓度为 10%～30%时更为明显（P<0.05）（图3）。

图1 紫外线照射前后成纤维细胞的生长曲线Fig.1 Growth curve of fibroblasts before and after ultraviolet irradiation

图2 不同浓度PRP培养的成纤维细胞倍增时间比较Fig.2 Comparison of cell doubling time in each group

图3 不同浓度PRP培养的成纤维细胞胶原蛋白与透明质酸合成比较Fig.3 Comparison of collagen and hyaluronic acid production of UV-A irradiated fibroblasts treated by different concentration of PRP

3 讨论

紫外线（UV）包括UVA与UVB，是导致皮肤发生老化的重要原因[1]。UVA是生活紫外线，可穿透玻璃和云层射入皮肤；UVB是户外紫外线，暴露在室外时直接接触UVB，但UVB易被云层阻隔[4]。日常生活中，人们主要接触UVA。因此，我们采用UVA照射皮肤成纤维细胞，以模拟日常的皮肤光老化。

皮肤光老化的研究中，皮肤成纤维细胞已成为研究重点[5-6]，包括光老化时细胞的基因[7]和受体的改变[8]，以及相关信号传导通路的变化等[9]。

目前的研究包括激光治疗[10]、细胞治疗[11-12]以及中药治疗等各种新方法[13-14]。本研究将富血小板血浆（PRP）作为研究对象，因为PRP有自源性且富含多种高浓度生长因子。因此，PRP不会出现异体的免疫排斥；同时PRP中各生长因子的比例与体内正常比例相符，使生长因子之间产生最佳的协同作用[15]。

透明质酸与胶原蛋白是人体真皮组织中的重要组成部分，随着紫外线的不断照射以及年龄的增加，皮肤内透明质酸与胶原蛋白的含量逐渐减低，真皮组织被氧化，皮肤塌陷、萎缩。皮肤在外观上表现为粗糙、干燥、皱纹增大、松弛等一系列衰老征象。

通过应用ELISA测定胶原蛋白、透明质酸功能变化，在体外实验中探索PRP是否有直接改善皮肤光老化可能。ELISA测定透明质酸功能变化结果显示，成纤维细胞接受紫外线照射后，其合成的胶原和透明质酸量较未被照射的成纤维细胞显著降低，伴随PRP使用浓度的增加，细胞合成的胶原与透明质酸量有增加的趋势，在PRP浓度为10%～30%时，其胶原与透明质酸量略有升高，当PRP使用浓度达到30%～50%时，其胶原与透明质酸量增加幅度明显。由于缺少定量分析，PRP是通过使单个细胞合成量增加，还是使细胞数量增加进而使胶原与透明质酸量升高，或是二者兼而有之，目前尚无法判断。

上述结果提示，使用PRP能改善皮肤光老化细胞的胶原以及HA的分泌功能。但PRP是否可以作为一种填充剂，被用于皮下注射，以实现减少皱纹、抗衰老的效果，还有待于进一步验证。

[1]Daniels F Jr.Sun exposure and skin aging[J].N Y State J Med,1964,64:2066-2069.

[2]Anitua E,Andia I,Ardanza B,et al.Autologous platelets as a source of proteins for healin tissue regeneration[J].Thromb Haemost,2004,91(1):4-15.

[3]林敏魁,闫福华.富血小板血浆用于牙周组织再生的研究Ⅰ、PRP的提取及对PDLFs增殖的影响[J].临床口腔医学杂志,2003,19(11):656-658.

[4]Robertson DF.Solar ultraviolet radiation in relation to sunburn and skin cancer[J].Med J Aust,1968,2(25):1123-1132.

[5]刘垠,刘流,王继华,等.转化生长因子β1对长波紫外线照射皮肤成纤维细胞线粒体DNA 4 977 bp缺失的影响[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(50):9883-9886.

[6]王继华,刘垠,何永静,等.TGF-β1对UVA照射皮肤成纤维细胞Ⅰ型Ⅲ型胶原合成和表达的影响[J].中国美容医学,2009,18(3):338-341.

[7]胡孝辉,高丰厚,方勇.UVB诱导人皮肤成纤维细胞中beta-catenin基因的变化研究[J].中国美容医学,2010,19(5):704-707.

[8]刘垠,刘流,王继华,等.长波紫外线照射皮肤成纤维细胞表皮生长因子受体的表达[J].中国组织工程研究与临床康复,2011,15(11):1965-1968.

[9]Lee YR,Noh EM,Jeong EY,et al.Cordycepin inhibits UVB-induced matrix metalloproteinase expression by suppressing the NF-kappaB pathway in human dermal fibroblasts[J].Exp Mol Med,2009,41(8):548-554.

[10]李雪莉,黄玉成,李天举,等.1319nmND:YAG激光治疗皮肤光老化的动物实验研究[J].实用皮肤病学杂志,2012,5(1):12-15.

[11]史春艳,王兵,张萍,等.MSCs对紫外线诱导皮肤光老化大鼠模型凋亡的影响[J].中国老年学杂志,2011,31(22):4413-4414.

[12]赵翠杨,田亚平,陈世义,等.MSCs对豚鼠光老化皮肤组织中Ⅰ型胶原表达的影响[J].中国老年学杂志,2011,31(4):654-655.

[13]王诗晗,吴景东,赵丽,等.黄芪醇提物抗紫外线诱导无毛小鼠皮肤光老化的作用研究[J].实用中医内科杂志,2011,25(5):44-46.

[14]杨汝斌,万屏,刘玲,等.SD大鼠光老化模型中氧化性损伤及灯盏花素的保护作用[J].中国老年学杂志,2012,32(6):1180-1182.

[15]Eppley BL,Woodell JE,Higgin J.Platelet quantification and growth factor analysis from plateletrich plasma:implications for wound healing[J].Plast Reconstr Surg,2004,114(6):1502-1508.

The Effect of PRP Promoting the Expression of Collagen and Hyaluronic Acid of Light Aging Human Skin Fibroblasts in Vitro

DENG Chenliang,CHANG Yi,WAN Weidong,ZHENG Jianghong,QU Yue,MAO Guangyu,DING Zhi,YANG Songlin.Department of Plastic Surgery,Shanghai Sixth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200233,China.

YANG Songlin(E-mail：alcee@126.com).

ObjectiveTo explore the effects of platelet-rich plasma (PRP)on collagen and hyaluronic acid(HA)expression of light aging human skin fibroblasts (HSFs)in vitro.MethodsCultured human skin fibroblasts were radiated with ultraviolet ray and the proliferation and doubling time of cell were estimated.Different concentrations(10%,30%and 50%)of PRP were added into cultured light aging human skin fibroblasts,and HSFs radiated with ultraviolet ray were taken as negative control and HSFs were taken as positive control.ELISA was used to measure collagen expression and hyaluronic acid expression.ResultsThe cell proliferation was prohibited after ultraviolet irradiation and cell doubling time was shortened with the increasing of PRP concentration after PRP added.ELISA assay showed that the collagen type 1(COL1),type 3 (COL3)and HA expression were decreased after ultraviolet irradiation and promoted after PRP added,significant difference was shown between expermental groups and negative control group (P<0.01).ConclusionPRP can promote the synthesis of collagen type 1(COL1),type 3(COL3)and HA,and may be used as an effective factor against skin photoaging.

Platelet-rich plasma;Light aging;Skin fibroblasts;Collagen;Hyaluronic acid

R594.1+1

A

1673－0364（2012）04－0201－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2012.04.005

国家自然科学基金（81000837）。

200233 上海市 上海交通大学医学院附属第六人民医院整形外科。

杨松林（E-mail：alcee@126.com）。

2012年6月7日；

2012年6月22日）