桑蝉止咳方提取工艺初步试验研究*

徐静逍, 罗晓丽, 李晋玉, 崔 涛, 毕 云, 熊丽娟

(1.云南中医学院, 云南 昆明 650500； 2.云南省药物研究所, 云南 昆明 650101； 3.昆明医学院, 云南 昆明 650031)

桑蝉止咳方由桑叶、木蝴蝶等组成，具有疏散风热，利咽止咳等功效，为治疗燥热型咳嗽的有效经验方，其活性成分大多溶于乙醇和水，因此笔者选用醇-水双提法以达到能最大限度提取方中有效成分的目的。本实验主要研究醇提部分的提取工艺，用正交实验法对影响提取工艺的醇浓度、醇用量、提取时间、提取次数等因素进行考察，以桑叶中的芦丁、木蝴蝶中的黄芩苷的转移率为工艺考察指标，通过正交试验结果计算影响该试验的主次因素，再结合生产实际确定优化的工艺参数。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters1525色谱仪Agilent 1200。

1.2 试药

1.2.1 试剂 提取用的乙醇为医用乙醇，含量测定用的甲醇、乙腈、均为色谱纯，冰乙酸(国药集团化学试剂有限公司)、磷酸(重庆川东有限公司化学试剂厂)醋酸铵(上海试四赫维化工有限公司)均为分析纯，配制溶剂用的水为自制超纯水。

1.2.2 对照品 绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号为110753-200212)，黄芩苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号为110715-200815)。

1.2.3 药材 该提取工艺所用桑叶、木蝴蝶等药材均购于云南省药材公司。

2 方法与结果

2.1 醇提部分的正交实验

2.1.1 醇提正交实验设计 根据前述各味药材所含成分及药理研究基础，按处方量称取药材，选取影响提取的几个主要因素醇浓度、醇用量、提取次数、提取时间为考察因素，每个因素设立如下表1的3个水平。

采用L9(34)正交表安排实验，按正交条件进行乙醇回流提取，滤过，滤液回收乙醇后再浓缩至小体积，置于水浴锅上烘至稠浸膏后置于真空烘箱中烘干。

2.1.2 各项指标测定方法 醇提干浸膏得率：按处方量称取药材，以L9(34)正交表设计的顺序各加入设定的乙醇用量，按规定的时间和次数回流提取，滤过，合并滤液，回收乙醇后浓缩成浸膏，置真空烘箱中减压干燥至干浸膏，称重计算干浸膏得率。

绿原酸、黄芩苷含量的测定：照高效液相色谱法(《中国药典》2005版一部附录Ⅵ D)测定[1]。

2.1.3 高效液相色谱法对绿原酸、黄芩苷含量的测定结果 供试药品、对照品溶液的制备及色谱条件：

桑叶药材：精密称取桑叶药材100.7 mg，置于具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，称重，超声提取30 min放冷后再称重，补足损失溶剂量，滤过，取续滤液，用0.45 um的微孔滤膜滤过备用，浓度为4.028 mg/mL。

绿原酸：取在105℃干燥至恒重的绿原酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL中含0.024 mg的溶液即得。

仪器：Agilent1200/007色谱仪；色谱柱：Waters SymmetryshieldTMRP18柱(4.6 mm*250 mm，5 um)；流动相：甲醇-0.5%磷酸水溶液(18：82)；流速：1.0 mL/min；柱温：25℃；检测波长：350 nm；进样量：10 uL。

用该法测定的绿原酸对照品、桑蝉样品、阴性对照品的HPLC图谱见图1～图3。

图1 绿原酸标准品

图2 桑蝉样品

图3 缺桑叶空白样品

木蝴蝶药材：精密称取木蝴蝶药材219.4 mg,置于具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，称重，超声提取30 min放冷后再称重，补足损失溶剂量，滤过，取续滤液，用0.45 μm的微孔滤膜滤过备用，浓度为8.776 mg/mL。

黄芩苷：取在105℃干燥至恒重的绿原酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL中含0.11 mg的溶液即得。

仪器：Agilent1200/007系列色谱仪；色谱柱：Waters SymmetryshieldTMRP18柱(4.6 mm*250 mm,5 μm)；流动相：甲醇(A)-0.5%磷酸水溶液(B)梯度洗脱，[0-32 min,A (40-40);32-35 min,A (40:45);35-40(45-45)〗；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；检测波长：316 nm；进样量：10 μl。

用该法测定的黄芩苷对照品、桑蝉样品、阴性对照品的HPLC图谱见图4～图6。

图4 黄芩苷标准品

图5 桑蝉样品

图6 缺木蝴蝶空白样品

2.2 各指标成分测定及计算结果 根据高效液相色谱法测定所得各指标成分的峰面积值，计算L9(34)正交表项下各指标成分的转移率，转移率的计算公式为：

转移率= 相应药材提取含量*提取物量/药材含量*药材量

转移率一般是50%以上。

结果见表2～表3。

表2 绿原酸转移率计算结果

表3 黄芩苷转移率计算结果

2.3 正交试验结果分析 见表4～表5。

表4 醇提工艺正交实验结果统计

综合评分M=绿原酸转移率/绿原酸转移率最大值*30%+黄芩苷转移率/黄芩苷转移率最大值*15%+其他药材65%。

表5 醇提工艺正交试验方差分析表

正交试验结论：以综合评分为标准，直观分析表明，在所选因素水平范围内，各因素作用顺序为提取次数>提取时间>醇用量>醇浓度，最佳提取方案A2B3C3D3，而方差分析结果表明因素A(醇浓度)、因素B(醇用量)、因素C(提取次数)因素D(提取时间)对实验结果均无显著影响(P>0.05)。由于各因素的统计学检验不具有显著性，且醇提取后还要进行水提，为降低成本，故将醇提工艺定为A2B2C2D2，即取药材量8倍的70%乙醇回流提取2次，每次2 h。

2.4 醇提验证试验 为了进一步考察优选工艺的可靠性及稳定性，取3份按处方量称取的药材，按醇提正交试验所得提取工艺即取药材量8倍的70%乙醇回流提取2次，每次2 h进行验证试验，测定结果见表6。

表6 醇提验证试验结果

从表6可看出，验证实验结果与正交表中最优实验组结果相当，指标成分的转移率都在50%以上，说明该优选工艺稳定可行。

3 讨论

桑蝉止咳方为多味药组成的复方，众所周知中药复方成分众多且复杂，为保证提取工艺的可控性，我们采用了高效液相色谱对多个有效指标性成分含量测定的定量控制方法，该方法具有可控性好，准确程度高的特点；而且多指标综合评价提取工艺较以往的单指标评价方法更为全面，但是中药复方的优势在于众多成份协同作用，以达到多靶点多方位治疗疾病的目的，因此否能有效治疗疾病并非简单的将各指标成分叠加，还应结合药理和和药效等方面的试验，才能进一步确定方剂的功效。

本醇提正交实验以综合评分为标准，直观分析结果表明，在所选因素水平范围内，各因素作用顺序为：提取次数C>提取时间B>醇用量A>醇浓度，最佳提取方案为最佳提取方案A2B3C3D3，而方差分析结果表明因素A(水用量)、B(提取时间)、C(次数)对实验结果均无显著影响(P>0.05)。醇提取后还要进行水提，为降低成本，故将醇提工艺定为A2B2C2D2，即取药材量8倍的70%乙醇回流提取2次，每次2 h，经醇提正交验证实验证明该工艺是稳定和可行的。

[1]国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：化学工业出版社，2005：附录Ⅵ D.