肝硬化患者胃黏膜中生长激素释放肽的表达

杜学芳，许 琳，卫红军，王 青

青岛大学医学院附属青岛市市立医院1.消化科;2.病理科，山东 青岛 266071

肝硬化患者胃黏膜中生长激素释放肽的表达

杜学芳1，许 琳1，卫红军2，王 青1

青岛大学医学院附属青岛市市立医院1.消化科;2.病理科，山东 青岛 266071

目的探讨失代偿期肝硬化患者胃黏膜中生长激素释放肽(Ghrelin)的表达。方法随机选取2009年5月－2012年4月就诊于青岛市市立医院的乙肝后肝硬化患者47例、慢性乙型肝炎患者18例，同时选取胃镜检查大致正常的健康志愿者19例作为对照组，用免疫组化的方法检测胃黏膜中Ghrelin的表达。结果①肝硬化组患者与对照组相比，胃黏膜内Ghrelin的阳性表达率下降(P＜0.05)，幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)感染率升高(P＞0.05)。② 慢性乙型肝炎组患者与对照组比较，胃黏膜内Ghrelin的阳性表达率下降(P＜0.05)，H.pylori感染率升高(P＞0.05)。③ 肝硬化组与慢性乙型肝炎组相比，胃黏膜内Ghrelin的阳性表达率下降(P＞0.05)，H.pylori感染率升高(P＞0.05)。④ 肝功能Child-pugh分级与Ghrelin的阳性表达率无相关性(P＞0.05);随着肝功能Child-pugh分级的增加，H.pylori的感染率呈上升趋势，但差异无统计学意义(P＞0.05)。⑤ 对照组、慢性乙型肝炎组、肝硬化组、Child-pugh A级、Child-pugh B级、Child-pugh C级组内H.pylori阳性的患者胃黏膜中Ghrelin的阳性表达率与H.pylori阴性的相比升高，但各组内两者间的比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。结论乙肝后肝硬化患者胃黏膜损伤，导致胃黏膜内Ghrelin的表达减少，推测Ghrelin可能成为预测肝硬化患者胃黏膜病变的程度的指标。H.pylori感染加重胃黏膜的损伤，建议早期干预治疗肝硬化患者的H.pylori感染。Ghrelin可能具有抵抗H.pylori感染的作用。

肝硬化;乙型肝炎;生长激素释放肽;幽门螺杆菌

肝硬化是常见的消化系统疾病，失代偿期肝硬化可出现多种危及生命的并发症，一直为困扰人类的世界性疾病。乙型肝炎在我国广泛流行，人群感染率极高，平均每年有高达10%以上的乙型肝炎患者发展为肝硬化，乙肝后肝硬化已经引起了广泛关注。Ghrelin是由28个氨基酸组成的多肽，主要由胃黏膜组织合成并分泌入血，很多研究发现Ghrelin与消化系统密切相关［1-3］。本研究以免疫组化的方法对肝硬化患者胃黏膜中Ghrelin的表达及与H.pylori感染的相关性做初步的探讨，旨在为肝硬化的诊断、预防和治疗提供帮助。

1 材料与方法

1.1 病例采集

1.1.1 实验组:随机选取2009年5月－2012年4月就诊于我院消化科的乙肝后肝硬化(失代偿期)患者47例，男29例，女18例，年龄25～68岁，平均年龄(47.59±17.36)岁。根据肝功能 Child-Pugh分级分为3组:A级19例、B级18例、C级10例。随机选取同期就诊于消化科的慢性乙型肝炎患者18例，男13例，女5例，年龄34～59岁，平均年龄(46.84±11.92)岁。入选标准:(1)乙肝后肝硬化及慢性乙型肝炎的诊断符合由中华医学会肝病学分会、中华医学会感染病分会、中国肝炎防治基金会联合颁布的《2010年慢性乙型肝炎防治指南》;(2)排除妊娠、哺乳期、糖尿病、甲亢、肿瘤、重大外伤史及手术史，近1个月来无化疗、放疗、未服用激素治疗。

1.1.2 正常对照组:随机选取健康志愿者19例为对照组，男11例，女8例，年龄25～68岁，平均年龄(51±18.74)岁。入选标准:(1)无明显特殊不适症状;(2)胃镜检查大致正常;(3)胃黏膜组织活检后行病理检查基本正常;(4)排除慢性肝病病史、肝癌病史，同时排除妊娠、哺乳期、糖尿病、甲亢、肿瘤、重大外伤史及手术史，近1个月来无化疗、放疗、未服用激素治疗。本研究由医院伦理委员会批准，受试者均已签署知情同意书。各组间年龄、性别均具有可比性。

1.2 仪器和试剂 兔抗人Ghrelin多克隆抗体购自北京博奥森有限公司。病理图像分析采用华中理工大学的图像分析软件。

1.3 病理标本的采集 常规胃镜准备，受试者均在晨起空腹清醒的情况下由经验丰富的医师行胃镜检查，并于胃窦部取黏膜组织1块。常规固定、包埋、切片。

1.4 幽门螺杆菌(H.pylori)检查 所有研究对象进行13C呼气试验检查及HE染色，两者均阳性者为H.pylori阳性。

1.5 免疫组化法检测胃黏膜内Ghrelin的表达 胃镜下于胃窦处取大小约1.0 cm×0.3 cm的组织1块，置于4%多聚甲醛中固定2～3 d，常规脱水透明，石蜡包埋，3 um连续切片常规病理学检查及免疫组化法染色。组织切片烤片2 h后，脱蜡、水化，沸水浴法抗原修复，双氧水封闭20 min，37℃下血清封闭20 min，滴加一抗(浓度为5 μg/L)，4℃过夜，二抗孵育20 min，DAB显色，苏木素复染，常规脱水、透明、封片、镜检。以PBS代替一抗做空白对照，结果为阴性。

1.6 免疫组织化学结果定量判断标准 胃黏膜组织免疫组化结果显示Ghrelin阳性表达的细胞散在于黏膜固有层的腺体，呈棕褐色颗粒沉积。染色后先在光学显微镜下做定性观察，随机选取互不重叠的5个视野，然后于高倍镜(400×)下观察判定Ghrelin表达的阳性情况，并取其平均值做为最后的结果。评分标准:①按显色深浅评分:0分:不显色;1分:浅黄色显色;2分:棕黄色显色;3分:棕褐色显色。② 按显色比例评分:1分:显色细胞占细胞总数＜25%;2分:显色细胞占细胞总数25% ～50%;3分:显色细胞占细胞总数51% ～75%;4分:显色细胞占细胞总数＞75%。最后以两者乘积得分值作为判定标准。0分为阴性;1～4分为弱阳性;5～9分为阳性;＞9分为强阳性。统计分析时，将弱阳性与阴性归为阴性(－)表达，强阳性与阳性归为阳性(+)表达，计算阳性表达率［4］。

1.7 统计学处理 应用SPSS 17.0软件进行统计学分析。对所得的计数资料的率比较用卡方检验，相关性分析采用 χ2相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝硬化组、慢性乙型肝炎组、对照组间Ghrelin表达阳性率的比较 慢性乙型肝炎组Ghrelin的阳性表达率(33.3%)较对照组(57.9%)明显下降(P＜0.05)，肝硬化组总体Ghrelin的阳性表达率(25.5%)较正常对照组明显下降(P＜0.05)，肝硬化组总体较慢性乙型肝炎组Ghrelin的阳性表达率有所下降，但二者间的差异无统计学意义(P＞0.05)。肝硬化Childpugh的分级与Ghrelin的阳性表达率差异无统计学意义(P ＞0.05，见表1)。

表1 各组胃黏膜中Ghrelin的表达Tab 1 The expression of Ghrelin in the gastric mucosa in different groups

2.2 各组间H.pylori感染率的比较 对照组H.pylori的感染率为10.5%，慢性乙型肝炎组H.pylori的感染率为27.8%，肝硬化组总体 H.pylori的感染率为29.8%，三者间的两两比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。Child-pugh A 级组 H.pylori的感染率为21.1%，Child-pugh B 级组 H.pylori的感染率为33.3%，Child-pugh C级组 H.pylori的感染率为40%，随着肝功能Child-pugh分级的增加H.pylori的感染率呈上升趋势，但差异无统计学意义(P＞0.05，见表2)。

2.3 H.pylori感染对胃黏膜Ghrelin表达的影响正常对照组、乙型肝炎组、肝硬化组总体、Child-pugh A级组、Child-pugh B级组、Child-pugh C级组中H.pylori感染的患者胃黏膜中Ghrelin的阳性表达率较无H.pylori感染的患者有所升高，但各组组内比较两者间的差异均无统计学差异(P＞0.05，见表2)。

表2 各组间H.pylori的感染率及其对胃黏膜Ghrelin表达的影响Tab 2 The infection rate of H.pylori in different groups and its influence on the expression of Ghrelin in gastric mucosa

对照组、乙型肝炎组、肝硬化组各组间的两两比较H.pylori的感染率差异无统计学意义(P＞0.05)，Child-pugh A级组、Child-pugh B级组、Child-pugh C级组各组间的两两比较H.pylori的感染率差异均无统计学意义(P＞0.05)。各组组内比较 H.pylori感染与Ghrelin差异均无统计学意义(P＞0.05)

3 讨论

肝硬化是以弥漫性纤维化为特征的肝组织结构异常，含有肝细胞变性坏纤维组织增生和肝结节再生的慢性进行性病理过程或疾病［5］。目前研究发现，肝硬化患者常伴有胃肠道的症状和胃黏膜的损害，同时经临床和实验研究证实肝硬化与胃肠道激素、胃肠道神经及其动力相互影响。H.pylori感染者占全球人口的一半以上，中国是H.pylori感染率较高的国家之一，感染率为35% ～87%，同时H.pylori感染与消化系统疾病密切相关。本研究主要旨在探讨肝硬化与Ghrelin、H.pylori感染的关系。

Ghrelin是在1999年由日本国立循环疾病中心Kojima等［6］首先在小鼠胃内分泌细胞及下丘脑弓状核中发现，它是由28个氨基酸构成的多肽，主要由胃组织的X/A样内分泌细胞产生，同时存在于下丘脑、弓状核、肠道、垂体、肾脏、胎盘、胰腺、睾丸等组织中。研究证实Ghrelin具有刺激GH的分泌，增强食欲，促进胃酸分泌，增进胃肠动力，保护胃黏膜等生物学功能。越来越多的研究表明Ghrelin受到多种不同生理病理状态的调节和影响.并对多种疾病的发生产生影响［7］。最近有研究显示，肝硬化患者胃黏膜Ghrelin表达增加，Ghrelin的水平随着肝功能Chlid-pugh分级的增加而上升［8］，也有研究证明胃黏膜中Ghrelin的表达与肝硬化无明显相关性［9］。有学者发现，Ghrelin在慢性活动性丙型肝炎血液中升高［10］，肝硬化患者肝移植后血液中Ghrelin的水平较移植前明显升高［11］。本研究结果显示，慢性乙型肝炎患者、乙型肝炎肝硬化患者胃黏膜中Ghrelin的表达较正常人明显下降。肝脏受损时，机体处于应激状态，表现为交感神经兴奋，副交感神经抑制，可造成消化道功能的普遍抑制，分泌、吸收减少，胃黏膜充血、水肿、糜烂、溃疡、静脉曲张等胃黏膜的损害［12］。Ghrelin主要由胃组织分泌，肝硬化引起胃黏膜病变，导致胃黏膜分泌的Ghrelin减少，因此我们认为肝硬化患者胃黏膜中Ghrelin的表达减少，推测Ghrelin可以作为预测肝硬化患者胃黏膜损伤程度的一项指标。同时本研究发现，肝硬化与慢性乙型肝炎组间的差异无统计学意义，肝功能Child-pugh的分级与胃黏膜中Ghrelin的表达无相关性，上述结果的差异可能与纳入的数据不同、疾病的程度不同、患者的体质不同有关。

H.pylori与胃黏膜萎缩、肠化生、糜烂及胃癌密切相关，但目前对于H.pylori感染与肝硬化、Ghrelin的相关性仍存在争论。本研究显示，肝硬化患者H.pylori的感染率(29.8%)较乙型病毒性肝炎(27.8%)、正常人(10.5%)有所下降，随着肝硬化的程度的加重，H.pylori的感染率呈上升趋势。我们认为可能是由于肝硬化时胃黏膜充血水肿缺氧，机体的防御机制下降，导致H.pylori的感染率升高。推测H.pylori感染与乙肝及肝硬化患者胃黏膜损害有关，早期根除H.pylori感染的治疗可能改善肝硬化患者胃部疾病的预后。本研究还发现，各组间H.pylori感染阳性的患者胃黏膜中Ghrelin的表达量高于H.pylori感染阴性的患者，可能与Ghrelin具有促进泌酸腺分泌HCO3-，具有保护胃黏膜，抵抗H.pylori感染的作用有关［13］。但各组间差异均无统计学意义，考虑与纳入的数据不足有关，H.pylori感染与肝硬化、Ghrelin的关系仍需要进一步的研究探索。

综上所述，肝硬化引起胃黏膜的损害，导致胃黏膜中Ghrelin的表达减少，Ghrelin可作为预测肝硬化患者胃黏膜病变程度的相关指标之一。乙肝及肝硬化患者H.pylori的感染率升高，推测H.pylori参与乙肝及肝硬化患者的胃黏膜的损伤过程，建议早期干预治疗乙肝及肝硬化患者H.pylori感染。同时我们认为Ghrelin可能具有保护胃黏膜，抵抗H.pylori感染的作用。

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Expression of ghrelin in gastic mucosa of patients with liver cirrhosis

DU Xuefang1，XU Lin1，WEI Hongjun2，WANG Qing1
1.Department of Gastroenterology;2.Department of Pathology，the Affiliated Municipal Hospital of Qingdao University，Qingdao 266071，China

ObjectiveTo investigate the expression of Ghrelin in gastric mucosa of patients with liver cirrhosis.Methods47 patients with HBV cirrhosis and 18 chronic hepatitis B patients at our hospital from May 2009 to Apr.2012 were enrolled in this study.19 healthy volunteers were taken as control group.The expression of Ghrelin in gastric mucosa was determined by immunohistochemistry staining.Results① The expression of Ghrelin in gastric mucosa of patients with liver cirrhosis was lower than that in the control group(P ＜0.05)，but the infection rate of Helicobacter pylori(H.pylori)of patients with liver cirrhosis was higher than that in the control group(P ＜0.05).② The expression of Ghrelin in gastric mucosa of chronic HBV-infected patients was lower than that in the control group(P ＜0.05)，but the infection rate of H.pylori of chronic HBV-infected was higher than that in the control group(P ＜0.05).③ The expression of Ghrelin in gastric mucosa of patients with liver cirrhosis was lower than that in the chronic HBV-infected group(P ＜0.05)，but the infection rate of H.pylori of patients with liver cirrhosis was higher than that in the chronic HBV-infected group(P ＜0.05).④ The expression of Ghrelin in gastric mucosa has no relationship with the Childpugh classification(P ＞0.05).With Child-pugh classification higher，the infection rate of H.pylori became higher too(P ＞0.05).⑤ In all the groups，the expression of Ghrelin in gastric mucosa of H.pylori positive patients was higher than that in the H.pylori negative patients(P ＜0.05).ConclusionBecause of the impairment of gastric mucosa，liver cirrhosis may reduce the expression of Ghrelin in gastric mucosa.Therefore，Ghrelin may be one of indexes which cloud forecast the conditions of gastric mucosa of patients with liver cirrhosis.H.pylori injures the gastric mucosa，so we should cure the infection of H.pylori in patients with HBV and liver cirrhosis early.Ghrelin may resist H.pylori imfection Hepatitis B

Liver cirrhosis;HBV;Ghrelin;Helicobacter pylori

R512.6+2

A

1006－5709(2012)11－1065－04

2012-04-11

10.3969/j.issn.1006-5709.2012.11.022

杜学芳，E-mail:dxf463134584@163.com

王青，主任，教授，研究方向:肝硬化内镜下治疗、溃疡性结肠炎等。E-mail:qingwangqingdao@yahoo.com.cn