DAPI联合PKH26标记骨髓干细胞在急性肝脏损伤模型小鼠肝内迁移的示踪作用

金世柱，韩明子，刘冰熔，曲 波，宋吉涛，褚艳杰，赵瑞波，黄 褀，班 翔

1.哈尔滨医科大学附属第二医院消化内科，哈尔滨 150086;2.哈尔滨医科大学基础医学院病理学教研室

DAPI联合PKH26标记骨髓干细胞在急性肝脏损伤模型小鼠肝内迁移的示踪作用

金世柱1，韩明子1，刘冰熔1，曲 波1，宋吉涛1，褚艳杰1，赵瑞波2，黄 褀2，班 翔2

1.哈尔滨医科大学附属第二医院消化内科，哈尔滨 150086;2.哈尔滨医科大学基础医学院病理学教研室

目的探讨PKH26和DAPI联合标记骨髓干细胞在肝脏组织内迁移过程中的示踪作用。方法用PKH26和DAPI联合标记从Balb/c小鼠骨髓中分离出骨髓干细胞，用CCl4腹腔注射的方法制备小鼠急性肝脏损伤模型后，将标记的BMMC经尾静脉移植入急性肝脏损伤模型小鼠体内，对照组经尾静脉注入磷酸盐缓冲液(PBS)。移植2周后取肝脏组织，通过激光共聚焦荧光显微镜观察骨髓干细胞向肝脏内迁移的情况。结果接受骨髓干细胞移植组小鼠肝脏组织内可发现DAPI和PKH26双重标记的骨髓干细胞。结论PKH26和DAPI可以联合标记向急性肝损伤模型肝组织迁移的骨髓干细胞，为体内示踪骨髓干细胞脑内迁移提供更加准确的实验方法。

DAPI;PKH26;骨髓干细胞

近年来干细胞移植技术的快速进展为急慢性肝脏疾病的治疗提供了新的治疗策略［1-2］。大量的基础与临床研究都证实骨髓干细胞(bone marrow stem cell，BMMSC)移植在促进损伤肝脏细胞再生及肝脏功能恢复方面均可发挥重要的作用。在相关动物实验等基础实验研究中，如何提供一个有效的体内示踪方法，为移植细胞在受体动物体内进行迁移、存活、分布和转化情况的有效示踪一直是干细胞研究领域的热点科学问题之一。有文献分别报道细胞核染料DAPI［3］和细胞膜染料PKH26［4-7］两种荧光染料均可良好地标记移植的细胞，但目前仅限于标记人胚胎脑神经干细胞、脐静脉细胞、BMMSC，而较少采用细胞核染料与细胞膜染料的联合标记技术进行骨髓干细胞的示踪;新近有实验研究将细胞核染料DAPI和细胞膜染料PKH26两者联合起来进行标记骨髓干细胞，证实了两者可以有效的示踪骨髓干细胞向局灶性脑缺血模型小鼠脑组织内迁移的情况，如果细胞核染料 DAPI和细胞膜染料PKH26双标方法在肝脏损伤模型中也能够成功进行，将为干细胞移植治疗肝脏疾病的研究手段提供另一个有效的示踪方法。本实验采用细胞核染料DAPI和细胞膜染料PKH26联合标记骨髓干细胞，监测经联合标记的骨髓干细胞向急性肝脏损伤模型小鼠肝脏组织内迁移的情况，进而来探讨细胞核染料DAPI和细胞膜染料PKH26联合标记骨髓干细胞的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康成年Balb/c小鼠，性别不限，体质量18～20 g/只，购买并饲养于哈尔滨医科大学附属第二医院动物实验中心。自由食水。在整个实验过程，对动物的处置符合哈尔滨医科大学实验动物伦理学标准。

1.2 主要试剂 DAPI(BIOX120338，碧云天);PKH26荧光染料(美国Sigma公司);DMEM培养基(美国GibcoBRL 公司);胎牛血清(fetalbovine serum，FBS，美国Hyclone公司);小鼠淋巴细胞分离液(上海恒信公司)。增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA，SC-7970，美国 Santa Cruz Biotechnology)。

1.3 实验方法

1.3.1 Balb/c小鼠急性肝脏损伤模型的制作:依据我们课题组既往的方法进行复制小鼠急性肝脏损作模型。具体方法参考我们课题组的相关研究文献［3-4］，本文从略。

1.3.2 骨髓干细胞的获取及标记:依据我们课题组既往的相关实验方法进行骨髓干细胞的提取、分离及标记。具体请参考我们课题组的相关研究文献［8-9］，本文从略。

1.3.3 骨髓干细胞移植:急性肝脏损伤模型复制成功后，将小鼠置于自制简易固鼠器中，用碘伏消毒尾部，以1 mL无菌注射器吸取0.3 mL上述标记过的骨髓干细胞液，经尾静脉注入。对照组于尾静脉注入0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)0.3 mL。之后将小鼠置于室温控制在20～25℃的动物房(清洁级)中正常饲养。

1.3.4 受体组中肝脏组织病理切片的制备:骨髓干细胞移植2周后，实验动物均被处死;用于免疫组织化学观察。具体方法如下:将小鼠麻醉，迅速开胸暴露心脏，行主动脉插管，剪开右心耳做为灌注液流出口，在10～20 min内经左心室灌注37℃生理盐水200 mL快速冲洗，然后灌注4%多聚甲醛/0.01 M磷酸盐缓冲液(4℃，pH=7.4)300 mL灌注固定，40 min内灌注完，迅速开腹取肝脏组织，放入4%的多聚甲醛固定液中，4℃过夜，然后放入30%蔗糖溶液中低温防护。在冰冻切片机内进行连续冰冻切片，切成等厚(15 μm)切片，每隔1片抽取1片，甘油封片后用共聚焦荧光显微镜观察。

2 结果

2.1 急性肝脏损伤模型的验证 在BALB/c小鼠腹腔注射四氯化碳后，第7天急性肝脏损伤达最高峰。肝脏大体形态学改变:肝脏组织明显肿胀、正常红润光泽失去而略显黄白、肝脏组织表面可见弥散分布的点状及片状出血点、质地偏韧、混有少量炎性渗出物(见图1-A1)。普通光镜下HE染色结果:肝脏组织结构紊乱，可以见到广泛的空泡样变性、脂肪样变性、水肿样变性，同时伴随细胞质空泡样改变、细胞核破裂、溶解及固缩现象。此外，在门静脉区及坏死的肝细胞周围围绕大量的炎症细胞(见图1-A2)。这些结果与急性肝脏损伤的组织病理学特点是一致的(见图1，A为模型组，B为健康对照组)。

图1 肝脏组织大体及HE染色结果(20×)Fig 1 Histology and morphology evaluation after CCl4administration(20×)

2.2 细胞核染料DAPI和细胞膜染料PKH26双重标记阳性细胞的检测 DAPI在波长为340 nm的激发光作用下发出蓝色荧光，PKH26在波长为551 nm的激发光作用下发出红色荧光;在共聚焦荧光显微镜下检测发现，接受干细胞移植组小鼠肝脏组织内可见到广泛分布的蓝色及红色标记的荧光光点，提示体外细胞核DAPI和细胞膜PKH26标记的骨髓细胞能够移植并定植在接受干细胞移植组实验动物的肝脏组织中;将DAPI(蓝色荧光)与PKH26(红色荧光)叠加后，可见到完全重叠并呈黄白色亮光点(见图2，A、B、C)。

图2 接受干细胞移植实验动物肝脏组织共聚焦荧光显微镜下检测结果(200×)Fig 2 Confocal images in recipient mice under laser confocal scanning(200×)

2.3 移植细胞表达FITC标记的PCNA 经FITC荧光二抗标记的核增殖抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)抗体检测移植干细胞的增殖情况，发现细胞核染料DAPI和细胞膜染料PKH26均阳性表达的细胞，同时也发出绿色荧光(FITC，荧光二抗标记，见图3，A～D)，而在对照组中没有发现阳性细胞的表达(见图3，E～H);提示定植在肝脏组织中的植入细胞在接受干细胞移植的实验动物的肝脏组织内存活并且能够发生增殖。

图3 肝脏组织激光共聚焦荧光显微镜下检测结果(200×)Fig 3 Colocalization of transplanted BMMSC pre-labeled by DAPI and PKH26 with PCNA(200×)

3 讨论

近些年来干细胞移植技术在再生医学中得到较快的发展，众多学者依据干细胞移植技术进行了大量的基础与研究，取得了令人瞩目的成果。干细胞移植治疗各种疾病得到了日益广泛的关注。但是干细胞移植技术也面临许多难题等待学者们的攻克。其中，如何将移植的干细胞进行有效的示踪成为干细胞移植领域的热点科学问题之一。既往有许多基础研究证实，荧光标记技术可以很好地将移植的干细胞进行示踪。但由于其假阳性结果难以鉴别，一直影响荧光标记技术的使用。本课题中采用近交系Balb/c小鼠，依据其高度的遗传相似性，进而有效地避开了BMMSC移植过程中的免疫排斥反应问题，可以认为将整个移植过程是自体BMMSC移植;使得在BMMSC移植过程中不需使用免疫抑制剂。课题组通过使用细胞核染料DAPI和胞膜染料PKH26两种荧光染料联合示踪移植的BMMSC，我们将其定义为“荧光双标法”。在受体组小鼠肝脏组织内成功地检查到了大量的移植的BMMSC;课题组在检测蓝色荧光的同时也检测红色荧光，以确定移植的BMMSC的转归及分布情况。结果发现蓝色荧光与红色荧光完全重合。在受体组肝脏组织中检测到PKH26、DAPI、PCNA-FITC阳性的细胞重叠成白色亮点，提示移植的BMMSC在定植部位存活并开始增殖，说明用本实验中的荧光双标法对移植的细胞没有毒性作用，是一种较为安全的BMMSC示踪技术。

课题组通过荧光显微镜，利用紫外光波长的光线激发细胞核DAPI染料。当DAPI与双股DNA结合时，最大吸收波长为358 nm，最大发射波长为461 nm，其发散光的波长范围含盖了蓝色至青绿色［10-13］。DAPI的发散光为蓝色，且DAPI和绿色荧光蛋白或Texas Red染剂的发散波长，仅有少部分重叠，研究人员可以利用这项特性在单一的样品上进行多重荧光染色［14］。DAPI作为一种细胞核染料能快速进入活细胞核中与DNA结合，因此DAPI对生物体而言，也被视为一种毒性物质或是致癌物。使用过程中应注意操作与个体防护。DAPI为一种荧光染料，可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，可以产生比自身强多倍的蓝色荧光。显微镜下可以看到显蓝色荧光的BMMSC，荧光显微镜观察BMMSC标记的效率高，且对活细胞无毒副作用［15］。而美国西格玛公司生产的PKH26是一种标记细胞膜的长脂肪族红色荧光染料，可以与细胞膜上的脂类区域稳定结合，其染色速度快，通常仅需2～5 min即可使活细胞均匀染色。在标记的BMMSC分裂过程中，荧光可均匀分配到每一个子细胞中。PKH26性质稳定，无细胞毒性，荧光衰减慢［11］。

本实验将红色荧光染料PKH26与蓝色荧光染料DAPI叠合，发现红色荧光与蓝色荧光完全重合，因此认为这些细胞即为移植来源的BMMSC。苔盼蓝实验检测存活率＞90%，表明联合细胞核染料DAPI和细胞膜染料PKH26对BMMSC进行示踪过程中，不影响被示踪的BMMSC的生物活力，不具有细胞毒性作用。从而进一步证实 DAPI和 PKH26适合联合示踪BMMSC。本课题仅观察了BMMSC移植2周后的组织形态学情况，没有进行远期的观察是本课题的不足之处。可以在后续的实验中进一步鉴定远期示踪效果，如移植BMMSC荧光衰减情况，细胞的生物活性等进行观察，为BMMSC示踪技术寻找一个更加便捷、高效的示踪技术。

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The tracing effect of BMMSC double-labeled by DAPI combined PKH26 in acute liver failure model of mice

JIN Shizhu1，HAN Mingzi1，LIU Bingrong1，QU Bo1，SONG Jitao1，CHU Yanjie1，ZHAO Ruibo2，HUANG Qi2，BAN Xiang2
1.Department of Gastroenterology and Hepatology，the Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University of Harbin 150086;2.Department of Pathology，Institute of Basic Medicine，Harbin Medical University，China

ObjectiveTo study the tracing effect of bone marrow stem cells double-labeled by DAPI combined PKH26 in mice model of acute liver failure induced by CCl4administration.MethodsBMSCs were harvested from BALB/c mice and then double-labeled by PKH26 and DAPI.The labeled cells were subsequently infused into the tail veins of mice in which acute liver injured model had been induced by CCl4administration.14 days after transplantation，the migration status of the cells was studied by fluorescence microscopy.ResultsPositive cells pre-labeled by DAPI combined PKH26 could be detected in the hepatic tissues.ConclusionBMSC double-labeled by DAPI combined PKH26 in mice present well tracing effect.

DAPI;PKH26;Bone marrow stem cell

R574.5

A

1006－5709(2012)11－1043－04

2012-06-02

10.3969/j.issn.1006-5709.2012.11.016

金世柱，医学博士，主治医师，研究方向:骨髓干细胞移植与肝脏再生医学。E-mail:shizhujin@126.com

韩明子，主任医师，教授，硕士研究生导师，研究方向:骨髓干细胞移植与肝脏再生医学。E-mail:hanmingzi92@163.com.cn