玉竹生物活性成分C对小鼠免疫功能的影响

郭秀珍，潘兴瑜

(中国医科大学基础医学院免疫教研室，辽宁沈阳110001)

玉竹(Polygonatum odoratum(Mill.)Druee)为我国常用中药，其性平、味甘，具有养阴、润燥、除烦、生津止渴等功效。现代药效学研究证明玉竹有抑制免疫功能、抗肿瘤、抗凝血、抗衰老和降血糖等作用［1-5］。在正常机体中，各种T细胞亚群相互作用，对免疫系统的功能进行调节，维持机体正常的生理功能。其中主要的是CD4+T细胞和CD8+T细胞的调节作用更为突出重要。CD4+αβT细胞根据分泌细胞因子的不同可分为Th1细胞和Th2细胞2个功能亚群，Th1细胞通过分泌细胞因子干扰素γ(interferon gamma，IFN-γ)抑制Th2细胞的功能，介导细胞免疫应答(迟发型超敏反应和CTL的特异性靶细胞)。反之，Th2细胞通过分泌白细胞介素4(interleukin-4，IL-4)和白细胞介素10(IL-10)可下调抗原提呈细胞，抑制Th1细胞增殖和其功能，相对提高体液免疫应答。实验研究发现玉竹生物活性成分A(玉竹提取物A)治疗1型糖尿病模型鼠的主要机制是抑制CD4+Th1细胞活性，增强CD8+T细胞的功能，纠正免疫调节功能失衡。前期实验结果己经证实玉竹生物活性成分A在一定程度上能刺激Th1细胞增殖，通过分泌细胞因子干扰素γ(IFN-γ)抑制Th2细胞的功能，增强细胞免疫功能。本文旨在进一步研究玉竹生物活性成分C(玉竹多糖)对小鼠细胞免疫功能的影响，探讨玉竹生物活性成分C对脾αβT细胞和γδT细胞的增殖以及CD4+αβT细胞/CD8+αβT细胞比值的影响，并揭示玉竹生物活性成分的作用机制，为玉竹生物活性成分C的进一步应用提供实验和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料BALB/c小鼠，雄性，18～20 g，SPF级，购自中国科学院北京实验动物中心，许可证编号:SCXK(京)200420001。

1.1.2 主要试剂玉竹生物活性成分C:由中国医科大学基础医学院免疫教研室潘兴瑜教授提供(玉竹采自辽宁省辽阳市东部山区，药用根茎，采用醇水法提取，得乳白色沉淀物真空冷冻干燥)，用RPMI-1640配成不同浓度，过滤除菌，4℃保存，以备用。FITC Hamster Anti-Mouse γδ T-Cell Receptor(BD，553177)，PE-cy7 Anti-Mouse αβTCell Receptor(BD，109222)，APC Rat Anti-Mouse CD4(BD，553051)，PE Rat Anti-Mouse CD8(BD，553032)，CFSE(Chemicon C375-10)，小鼠IFN-γ ELISA检测试剂盒(R＆D公司)、小鼠IL-4 ELISA检测试剂盒(R＆D公司)等。

1.1.3 主要仪器流式细胞仪:BECTON DICKINSON公司，FACSCAN，美国;酶标仪:InterMed NJ-2100;CO2恒温培养箱:TopIncu 150，香港;电子分析天平:L-1660DTP，日本Shimadzu;倒置显微镜:IMT-413日本OLYMPUS。

1.2 方法

1.2.1 玉竹生物活性成分C对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响①MTT比色法:取清洁级6～8周龄雄性BALB/c小鼠，无菌条件下取小鼠脾淋巴细胞，制备脾细胞悬液。于37℃、5%CO2条件下培养2 h，去除贴壁细胞，收集、离心和清洗后计数细胞数为5×106/mL。分组包括正常对照组和Con A(Con-A7 μg/mL)阳性对照组，玉竹生物活性成分C浓度各实验组(5 000、4 500、4 000、3 500、3 000、2 500、2 000、1 500、1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.625 μg/mL)，每孔100 μL的细胞悬液，各孔终体积为200 μL，细胞终密度为5×105/mL，一式3复孔，培养96 h后加MTT(5 mg/mL，20 μL/孔)4～6 h后测OD值，λ570nm;②CFSE染色法:分离小鼠脾淋巴细胞方法同①，细胞密度1×106/mL，加5 mmol/L/5 μL CFSE染色30 min(温箱37℃孵育)后加冷10%FCS-RPMI1640液终止染色，洗3遍后加入24孔培养板中，每孔500 μL，一式3复孔，采取同样分组，正常对照组、Con A(Con A 7 μg/mL)对照组和实验组(玉竹生物活性成分C浓度为1 000 μg/mL)。在37℃、5%CO2条件下培养96 h，重新计数细胞为1×106/mL，流式细胞仪检测细胞增殖程度。

1.2.2 玉竹生物活性成分C对αβT细胞和γδT细胞增殖的影响分离脾淋巴细胞方法同①，细胞密度1×106/mL，加入24孔培养板中，每孔500 μL，一式3复孔，采取同样分组，空白对照组、Con A对照组和玉竹生物活性成分C(1 000 μg/mL)。在37℃、5%CO2培养条件下培养96 h，重新计数细胞为1×106/mL，在标记T细胞β和δ链荧光抗体进行检测。

1.2.3 玉竹生物活性成分C对CD4+αβT细胞/CD8+αβT细胞比值的影响分离脾淋巴细胞方法同①，1×106/mL，加入24孔培养板中，每孔500 μL，一式3复孔，采取同样分组，空白对照组、Con A对照组和玉竹生物活性成分C(1 000 μg/mL)。在37℃、5%CO2培养条件下培养96 h，重新计数细胞为1×106/mL，在标记T细胞APC、PE荧光抗体进行检测。

1.2.4 玉竹生物活性成分C对T细胞产生IL-4和IFN-γ水平的影响分离淋巴细胞同①，细胞密度1×106/mL，加入24孔培养板中，每孔500 μL，一式3复孔，采取同样分组，正常对照组、Con A对照组和玉竹生物活性成分C浓度(1 000 μg/mL)。在37℃、5%CO2条件下培养72 h，用双抗夹心ELISA试剂盒分别检测小鼠脾脏淋巴细胞培养上清中IFN-γ和IL-4的分泌水平，酶标仪测定450 nm处OD值。结果以试剂盒提供的标准品绘制标准曲线，应用Soft Max Pro4.3.1 Ls软件分析，计算细胞因子含量(pg/mL)。

1.2.5 统计学处理数据采用SPSS16.0软件进行分析，计量资料以¯χ±s表示，多样本均数比较应用单因素方差分析(One-way ANOVA)，样本均数间的多重比较采用LSD检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 玉竹生物活性成分C对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响

图1 不同剂量的玉竹生物活性成分C对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响Fig.1 Different doses of the Polygonatum odoratum effective component C on the proliferation of mouse spleen lymphocytes influence

图2 玉竹生物活性成分C(1 000 μg/mL)对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响Fig.2 The Polygonatum odoratum effective component C(1 000 μg/mL)on the proliferation of mouse spleen lymphocytes influence

MTT比色法:经MTT检测发现玉竹生物活性成分C在5 000、4 500、4 000、3 500、3 000、2 500、2 000、1 500、1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.625 μg/mL浓度范围内对小鼠淋巴细胞均有增殖作用，如图1所示。其中以1 000 μg/mL的增殖作用最大(P＜0.01)，且未发现对淋巴细胞有直接的细胞毒作用。

CFSE染色法:CFSE染色法检测细胞增殖程度，其结果见图2。实验组显著高于正常对照组和阳性对照组(P＜0.01)。

2.2 玉竹生物活性成分C对αβT和γδT细胞增殖的影响

检测细胞增殖结果见图3。实验组αβT细胞的百分率显著高于空白对照组αβT细胞的百分率(P＜0.01)。而γδT细胞主要存在于肠黏膜上皮间和胸腺等部位，玉竹生物活性成分C刺激增殖的主要是αβT细胞。

图3 玉竹生物活性成分C(1 000 μg/mL)对αβT细胞增殖的情况Fig.3 The Polygonatum odoratum effective component C(1 000 μg/mL)on αβT cell proliferation

2.3 玉竹生物活性成分C对CD4+αβT和CD8+αβT细胞比值的影响

玉竹生物活性成分C对CD4+αβT和CD8+αβT细胞的影响见表1。实验组αβT细胞中的CD4+T细胞/CD8+T细胞的比值低于正常组和Con A阳性对照组的比值(P＜0.05)。

表1 玉竹生物活性成分C(1 000 μg/mL)对CD4+αβT和CD8+αβT细胞比值的影响Table 1 The Polygonatum odoratum effective component C(1 000 μg/mL)on ratio of CD4+αβT and CD8+αβT cell group influence

2.4 玉竹生物活性成分C对IFN-γ和IL-4产生的影响

表2 各组细胞培养上清中IFN-γ和IL-4含量的变化Table 2 Clusters of cells in culture supernatant of IFN-γ and IL-4 content change

采用ELISA法检测小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-4含量，结果见表2。实验组与正常和Con A对照组比较IFN-γ的产生水平显著升高(P＜0.01)，而对IL-4的产生没有发生影响。

3 讨论

经研究发现玉竹生物活性成分C具有增强细胞免疫功能的作用。在本实验中，采用玉竹生物活性成分C体外共培养刺激，在15.625～5 000 μg/mL浓度范围内对小鼠脾淋巴细胞的增殖均有诱导作用，并呈现一定的剂量依赖关系。其中以1 000 μg/mL浓度的增殖作用最大。对小鼠脾淋巴细胞没有发现有直接的细胞毒作用。本研究又进一步发现玉竹生物活性成分C对CD4+αβT细胞/CD8+αβT细胞比值有降低作用，说明玉竹生物活性成分C对CD8+αβT细胞有一定的选择性诱导增殖的生物活性作用，而对CD4+αβT细胞几乎没有诱导增殖的作用。玉竹生物活性成分C对小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ的产生具有明显的提升作用，而对IL-4的产生好像没有明显的作用［6-8］。玉竹生物活性成分C在衰老模型鼠中玉竹多糖有延缓细胞以及体液免疫功能衰老的作用，在抗衰老小鼠脾脏CD4细胞数各组间无明显差异，正常对照组和不同剂量玉竹生物活性成分C治疗组的CD8细胞数显著高于衰老模型组，CD4+/CD8+比值则明显低于衰老模型组，均提示玉竹生物活性成分C对亚急性衰老小鼠免疫器官的功能具有一定的调节作用，能明显改善衰老小鼠T细胞增殖能力，增强其对外来抗原的反应性。亦具有增加脾脏中CD8+T细胞数量的趋势，降低CD4+/CD8+比值，改善了机体的免疫失衡状态，增强机体的细胞免疫功能。也有报道玉竹生物活性成分C具有降血糖的作用，玉竹生物活性成分C在预免疫的小鼠脾脏组织中的淋巴细胞以CD8+T细胞亚群为主，CD4+/CD8+亚群比例下降，其胰腺组织中的CD4+T细胞浸润明显减少。这说明玉竹生物活性成分C预防小鼠糖尿病发病的机制之一也是纠正其T细胞亚群的免疫失衡状态。CD8+T细胞曾被分为CTL和Ts细胞2个功能亚群，后来又根据CD8+T细胞分泌细胞因子的谱系重新分为Tc1(CTL或CD8+Th1)细胞和Tc2细胞(CD8+Th2)2个功能亚群。Tc1

细胞具有较强的杀伤活性，可分泌IFN-γ，介导适应性细胞免疫应答，主要清除病毒感染的靶细胞和肿瘤细胞。Tc2细胞具有较弱的杀伤作用，主要分泌IL-4、IL-10等。据此，暗示玉竹生物活性成分C对Tc1(CTL或CD8+Th1)细胞的功能具有明显的促进作用，可能有抗病毒和抗肿瘤的应用前景。已有研究表明玉竹生物活性成分C是一种低毒安全的中药提取物。本研究将为临床开发玉竹生物活性成分C用于抗病毒和抗肿瘤［9-10］等疾病的药物以及进一步研究其作用机制提供实验依据。

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