磷脂酰丝氨酸制备的研究进展

孙明波，刘天薇，王继文，张怡轩*

(1.沈阳药科大学生物制药教研室，辽宁沈阳110016;2.沈阳天峰生物制药有限公司，辽宁沈阳110003)

磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)又称丝氨酸磷脂或二酰甘油酰磷酸丝氨酸，是一种天然磷脂，1942年由Jordi［1］首次提取并命名。磷脂酰丝氨酸并非单一成分，而是一组化合物，这是由于不同来源的原料所提取的产品的脂乙酰残基的变化较大而造成。PS以甘油为主要骨架，1、2号碳原子上面连接脂肪酸，构成它的非极性尾部，3号碳原子连接一个带丝氨酸的磷脂，构成它的极性头部(图1)。

1 磷脂酰丝氨酸的分布

磷脂酰丝氨酸存在于所有的动物、高等植物以及微生物的生物膜中。通过对典型的哺乳动物细胞中磷脂含量的研究发现，真核细胞膜中含量最丰富的磷脂为磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)，占总磷脂含量的40%～50%［1］。而PS含量相对较少，约占总磷脂含量的2%～10%。通过研究还发现，有机体不同组织中PS的含量不同，脑组织中的PS含量远远大于肝脏组织中［2-4］。在高等植物中，磷脂酰丝氨酸主要存在于植物种籽中，但含量并不高。在玉米种子中，磷脂酰丝氨酸的含量约为1.0%［5］，而在大豆中，磷脂类物质占大豆总重的1.6%～2%，这其中磷脂酰丝氨酸只占0.5%～1%，即每千克大豆中只含有80～200 mg磷脂酰丝氨酸［6］。

图1 磷脂酰丝氨酸结构Fig.1 The structure of Phosphatidylserine

2 磷脂酰丝氨酸的制备方法

磷脂酰丝氨酸的制备方法比较多，其中主要以提取法和酶转化法为主。

2.1 提取法

提取法主要是从植物种籽、动物的脑及肝脏中提取PS。由于植物中的PS含量较少，所以提取法以动物组织中提取为主。从动物中提取主要是动物的大脑及内脏，目前国外提取PS大部分以牛、羊、兔、马、驴等家畜的动物脑为原料。磷脂酰丝氨酸存在于组织的脂类物质里，要想得到纯净的磷脂酰丝氨酸，首先要把粗磷脂从组织中进行浓缩分离，然后再通过TLC法、硅胶柱色谱法、氨基键合硅胶柱色谱法、高效液相色谱法等方法对粗磷脂进一步分离纯化。粗脂质的提取方法目前最常用的主要有氯仿-甲醇-水提取法［7-8］、己烷-异丙醇提取法等［7，9］。近年来由于疯牛病的原因，利用动物大脑提取PS的方法获得的产品安全性受到人们的怀疑，此种方法现在已处于淘汰边缘。

2.1.1 氯仿-甲醇-水提取法1959年，Bligh等［8］以鱼类肌肉组织为原料、氯仿-甲醇-水为溶剂进行粗脂质的提取。取100 g鳕鱼肌肉(含80%水分及1%磷脂)作为原料，在常温下向组织中加入300 mL氯仿-甲醇(体积比1∶2)混合溶剂，捣碎2 min使其均匀分散，然后向混匀的混合物中加入100 mL氯仿并搅拌30 s，此后加入100 mL蒸馏水继续搅拌30 s，产生溶解了脂质的氯仿相和溶解了非脂质的甲醇-水相，过滤，收集氯仿下清液，然后再加入一定量的甲醇-水溶液进一步除去剩余的油类杂质，在氮气条件下蒸除氯仿，再蒸干得粗磷脂。此种方法已被报导适用于鱼类肌肉组织中粗磷脂酰丝氨酸的提取，且操作简单，溶剂来源广泛，处理量大，但是由于氯仿具有毒性，且成本较高，因此研究其他方法来替代氯仿萃取生产磷脂酰丝氨酸十分必要。

2.1.2 己烷-异丙醇提取法鉴于氯仿-甲醇-水提取法的毒害作用，1978年，Atsushi等［9］将1 g小鼠脑组织和18 mL己烷-异丙醇(体积比3∶2)混合均质30 s，过滤后，所有的容器和组织残留物再用己烷-异丙醇漂洗3次，然后收集到一起的溶液在12 mL硫酸钠溶液(1 g固体硫酸钠与12 mL水混合)中搅拌1 min，静置分层，上层即为所需的粗脂质层。Atsushi Hara等将此法与氯仿-甲醇-水提取法进行实验比较发现，以1 g小鼠脑组织为原料，用氯仿-甲醇-水提取法提取出粗脂质79.5 mg，含有3.2 mg蛋白质脂质蛋白;而用己烷-异丙醇提取法提取得到产物72.9 mg且未检测到蛋白质脂质蛋白。由此可见，此法比氯仿-甲醇-水提取法更经济，对实验者的安全更可靠，同时避免了蛋白质脂质蛋白的影响，在形成两相时的冲洗时间更短，同时，溶剂密度低，足以通过离心作用得到匀浆，来替代其他溶剂的过滤作用，提取效果较好，洗净的提取物可在远紫外区用于色谱柱的连续监测洗脱，但此方法不能对神经节苷脂进行有效分离。

2.1.3 其他方法2005年，山东师范大学刘代成等［10］公布发明专利《一种从动物脑提取磷脂酰丝氨酸的方法》，其首先将干燥动物脑碎成0.2～0.4 cm的颗粒，再向颗粒中加入体积为3～5倍量的丙酮，搅拌萃取，除去含有干脑粒中胆固醇和油类的丙酮上清液，残渣蒸干。然后向蒸干的残渣中加入过量的乙醚，得到乙醚提取液，可蒸去大部分乙醚使剩余的乙醚溶液体积为乙醚提取的干物质的3～5倍量。将该乙醚溶液加入到pH 7.5～11的Na2CO3水溶液中成盐，搅拌1 h，-10～-20℃冻结，4～7℃缓慢解冻。除去下部沉淀，将上清液用2%～5%HCl调pH 3～6。蒸除乙醚，蒸干水分得干粉;或蒸除乙醚后加入与剩余溶液同量的正己烷，搅拌分层，取上部正己烷层，蒸去正己烷得干物质。然后再向干物质加入3～5倍正己烷，再加入体积5～10倍于干物质量且含醋酸钠的40%～60%乙醇溶液搅拌，静止分层，除去下部白色沉淀(主要为肌醇磷脂)取上部正己烷层，蒸干得磷脂酰丝氨酸，磷脂酰丝氨酸纯度为90%～93%。目前国内西安楚康生物科技公司、西安三维生物技术有限公司、陕西信瑞生物科技有限公司等通过提取法从天然大豆榨油剩余物中提取的磷脂酰丝氨酸粗品已经上市，美国的NATURE'S BOUNTY公司提取自纯天然大豆卵磷脂中的磷脂酰丝氨酸已经以软胶囊的形式上市，并热销于国内外。但是，磷脂酰丝氨酸的提取工艺用到大量的有机试剂，且工艺比较复杂，对于磷脂酰丝氨酸的工业化生产很不利，提取法目前要解决的就是优化提取工艺，用组成简单且用量少的溶剂提取出较多的磷脂酰丝氨酸。

2.2 酶转化法

酶转化法主要是以天然的卵磷脂为基质，加入L-丝氨酸，在磷脂酶D(phospholipase D，PLD)或磷脂酰丝氨酸合成酶(phosphatidylserine synthase，PSS)的作用下，生成磷脂酰丝氨酸(PS)。

磷脂酶D，即磷脂酰胆碱磷脂水解酶PLD(EC3.1.4.4)，广泛存在于植物、动物及各种微生物如酵母、细菌中。磷脂酶D属于催化磷酸二脂酯键水解和碱基交换反应的一类酶的总称，属于磷脂酰二酯合成酶类，具有该家族的明显特征，即含有2个间隔出现的H(x)K(x)4D保守序列，该保守基序是催化水解的活性部位。H(x)K(x)4D残基在PLD活性中的作用已在酵母PLD特异位点诱变实验中得到证明，改变其中任何一个残基都会导致PLD活性的丧失［11］。试验证明［12］，PLD以保守的组氨酸残基对底物进行亲和攻击，通过两步乒乓反应机制水解断裂P-O键，即PLD与磷脂酰胆碱(PC)首先形成一个复合物，而后PLD-PC复合物变为PLD-磷脂酰酰基复合物并同时释放一个胆碱分子，此后，一个亲核分子或水分子与化合物结合。最后，从复合物中释放，合成一个新的磷脂。

磷脂酰丝氨酸合成酶(又称丝氨酸-磷脂酰转移酶:L-serineO-phosphatidyltransferase，PSS;EC 2.7.8.8)［13］，是磷脂酶D家族成员之一，可以催化底物相中的磷脂类物质和水相中亲核供体发生类似于酯缩合的转酯反应，是合成特定的新的磷脂类物质的良好工具酶。PSS在细菌、酵母、哺乳动物细胞中均有发现，其中细菌类特别是大肠埃希菌(E.coli)具有培养容易、抗性强等诸多特点，为实验研究的首选出发菌株。源自大肠埃希菌的磷脂酰丝氨酸合成酶通过催化特定的反应，能够合成大肠埃希菌自身所需的大部分磷脂类物质。2.2.1磷脂酶D和PSS的来源Hanahan等最先从胡萝卜根和白菜叶的提取物中获得PLD酶，揭开了PLD研究的序幕。植物PLD主要集中于叶片、根和种子等器官中，并随着植物生长发育的转变而变化。1994年，王学敏等［14］以萌发中蓖麻种子的子叶为试材，经过提取、分离与纯化，获得有活性的PLD酶。到目前为止已从蓖麻籽、拟南芥、草莓、豇豆、甘蓝、烟草、茴芹、垂头菊、棉花、水稻、玉米中分离克隆到完整的PLD cDNA序列，且其中已有部分得到纯化。植物PLD由复杂的基因家族编码，在拟南芥PLD基因研究中，已测定出7条编码PLD的基因，其中4条位于染色体Ⅳ，2条位于染色体Ⅱ，1条位于染色体Ⅲ。PLDα基因位于染色体Ⅲ，PLDβ基因位于染色体Ⅱ，PLDγ和PLDγ2基因位于染色体Ⅳ，PLDγ基因簇中发现的第3种编码PLD基因命名为PLDγ3，染色体Ⅳ和Ⅱ上的另外2条编码PLD基因标记为PLDδ1和PLDδ2［15］。

PLD在各种微生物中也广泛分布。至今已报导的产磷脂酶D的微生物主要有链霉菌、棒状杆菌、大肠埃希菌、沙门菌以及假单胞菌。其中，磷脂酶D在链霉菌中分布最为广泛，报导也最多。研究发现，微生物来源磷脂酶D与动植物来源磷脂酶D相比，具有较强的底物耐受性，较宽的底物专一性和较高的碱基交换反应催化活性，更适合于工业应用。在基因工程菌方面，1994年，Y等［16］成功地构建含有链霉菌来源的PLD质粒，并在大肠埃希菌表达系统中成功表达。

在哺乳动物细胞中PLD有PLD1和PLD2 2种亚型，PLD1主要位于核周围，如高尔基体、内质网、溶酶体及其分泌囊泡，而PLD2主要位于质膜上，2003年，朱玲等［17］从Daudi细胞中提取mRNA，经剪切、拼接变构，克隆获得了不含膜结合部位及信号肽的，可编码631个氨基酸的PLD2 cDNA序列。采用Vector NTI、DNATools等计算机分析软件及信息库，研究了重组人磷脂酶D2(rh-PLD2)变构体的生物学特征。rhPLD2具有多种基因结构和功能调控元件，朱玲等对其氨基酸序列进行分析发现在此氨基酸序列中还含有2个连接糖基侧链的与天冬酰胺一致序列(Asn-Xaa-Thr/Ser)，分别是N-F-T(261～263)和N-A-T(564～566)，由于这2个潜在的糖基化位点的存在，其编码的蛋白质具有发挥功能所必需的活性保守基序和一定的空间结构，因此推测rhPLD2应是一种具有一定生物学功能的异质性蛋白质。

PSS目前在细菌、酵母和哺乳动物细胞中均有发现，其中，源自大肠埃希菌的磷脂酰丝氨酸合成酶具有PLD家族明显的序列特征，即含有2个间隔出现的H(x)K(x)4D保守序列，它能够催化合成大肠埃希菌自身所需的大部分磷脂类物质，而不同于其他革兰阴性菌的磷脂类物质合成酶，并不紧密连接于细胞膜结构。对其进一步定位研究发现，该酶是一种外膜蛋白，主要通过脂类底物和弱酸性磷脂物质的电子传递链与膜表面互相作用。目前报导的PSS的来源方法主要是通过基因工程菌的构建，来源于小麦、大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌等的PSS均在大肠埃希菌表达系统中得以成功表达。

2.2.2 磷脂酰丝氨酸的酶法制备PLD是具有特殊性质的酯键水解酶，它能水解磷脂分子中的P-O键，水解产物为磷脂酸和羟基化合物。除水解作用外，在特定条件下，还能催化一些含羟基的化合物结合到磷脂的酰基上，形成新的磷脂，这一特性称为PLD的碱基交换反应。利用此特性可对磷脂进行改性，制备高纯度的单一磷脂和稀有磷脂。以PC和L-丝氨酸为底物，可以进行磷脂酰丝氨酸的酶法合成。

1997年，De等［18］公布发明专利《Process for the industrial preparation of phosphatidylserine》，初步确定了工业化生产磷脂酰丝氨酸的流程。以来源于蛋黄的磷脂酰胆碱原料为例，13 g蛋黄卵磷脂(PC含量为60%)溶于158 mL甲苯中，加入38 g L-丝氨酸、1.4 g无水CaCl2以及由链霉菌ATCC 55717菌株发酵产生的PLD酶液300 mL，同时加入1.7 g醋酸钠并加入冰醋酸使水溶液pH约为4.1，25℃强烈搅拌6 h后停止反应，得到7.3 g PS。

2008年，西北大学杨志彪［5］对初步筛选得到的可以产生磷脂酶D的链霉菌通过单孢子分离纯化菌种，挑选出产磷脂酶D能力较强的链霉菌菌株。通过对此链霉菌萌发处理的培养液在磁力搅拌器上边搅拌边进行紫外线诱变，进行了菌种选育，使菌种的产磷脂酶D能力提高了27%。同时，对发酵制备的酶液进行初步的分离纯化处理，使得发酵液中磷脂酶D的活力提高了2.8倍。同时，对两相体系合成磷脂酰丝氨酸的工艺进行研究，通过对缓冲液种类、丝氨酸用量、反应体系有机溶剂的选择、pH、温度、两相体积比、最适条件下酶液用量，以及分批搅拌补充酶液工艺的研究，确定了链霉菌PLD催化合成磷脂酰丝氨酸的基本工艺条件:丝氨酸以0.1 g/mL的浓度溶入浓缩的发酵酶液中，pH值5.5。此酶液与溶解有大豆磷脂的乙醚以1∶2的体积比混合，在28℃的条件下搅拌反应。

2007年，天津科技大学李斌等［19］利用表达载体pET-22b，实现了大肠埃希菌磷脂酰丝氨酸合成酶PSS基因在大肠埃希菌BL21(DE3)中的同源高效表达，利用镍亲和柱对表达产物进行纯化，将纯化后的重组酶作用于底物卵磷脂和丝氨酸定向合成磷脂酰丝氨酸，制备和检测方法如下:30 mL的0.1 mol/L醋酸钠缓冲液(pH 5.5)中含有0.15 mol/L丝氨酸，同时加入1 mL纯化后的重组磷脂酰丝氨酸合成酶，与15 mL含有0.75 mmol卵磷脂的氯仿进行混合，在30℃下200 r/min混合得到均匀的乳状液进行反应。反应6 h后，停止转动，双液相静止分层。提有机相取1 mL，经挥发后，剩余物经氯仿洗涤2次，最后溶解于50 μL氯仿中，HPLC法分析产物生成量。采用的流动相为乙腈∶甲醇∶85%磷酸=100∶10∶0.8，检测波长206 nm，样品进样量15 μL，流速为1.0 mL/min，利用外标法(以磷脂酰丝氨酸标准品为外标物)计算底物卵磷脂的转化率。磷脂酰丝氨酸合成酶的酶活定义:pH 5.5、30℃下，每小时转化1 μmol大豆卵磷脂所需要的酶量(mg)。经6 h的转酯反应转化率达到33%，重组磷脂酰丝氨酸合成酶PSS活力达到69 U/mg(蛋白)。同时，利用表达载体pET22-b(+)，实现了色褐链霉菌［20］磷脂酶D基因在大肠埃希菌BL21(DE3)中的高效表达。结果表明，目的蛋白可在短时间内进行大量表达且转酯反应6 h后卵磷脂的转化率达到31%，重组磷脂酶D活力达到39 U/mg(蛋白)。

2008年，天津科技大学申请了磷脂酰丝氨酸合成酶的制备方法专利［21］，采用枯草芽胞杆菌系统表达磷脂酰丝氨酸合成酶基因，解决了出发菌株磷脂酰丝氨酸合成酶(PSS)表达量低的问题，发酵后粗酶液经硫酸铵盐析、中空纤维膜除盐浓缩、离子交换层析、凝胶层析等步骤可获得高纯度的磷脂酰丝氨酸合成酶，具有制备工艺简单、酶活力高等优点，克服了现有提取技术中大量有机溶剂使用的不足，适合工业化生产。

3 磷脂酰丝氨酸的应用

磷脂酰丝氨酸(PS)可由人体利用丝氨酸合成产生，它可影响脑内化学讯息的传递，并帮助脑细胞储存和读取资料，是维持大脑正常记忆力、反应和健康情绪的重要营养元素。其药理作用表现在以下5方面:①改善记忆力、延缓脑疲劳，治疗老年痴呆症。A等［22］对有记忆损伤的年长大鼠进行莫理斯(Morris)水下迷宫逃生试验研究，结果发现大鼠的空间回忆和被动回避反应的记忆能力得到了大幅度改善;②治疗儿童多动症。内科医生的临床试验研究显示，对21个多动症患者(4～19岁)进行200～300 mg/d剂量的PS饮食摄入，连续摄入4周后发现，注意力和学习能力有显著提高［23］;③缓解精神压力。Hellhammer等［24］研究了大豆磷脂酸和磷脂酰丝氨酸混合物PAS对人精神压力的影响，以安慰剂为对照进行社会压力测验(TSST)后，发现400 mg PAS对其有明显缓解作用，且对心率无影响;④治疗抑郁症。Brambilla等［25］研究发现磷脂酰丝氨酸能够调节大脑中控制情绪的神经递质的激素水平，患者抑郁度平均降低70%，情绪紊乱、行为异常、焦虑、易怒等症状得到了显著改善;⑤竞技运动营养。Kingsley等［26］研究发现，每天补充从大豆中提取的PS 750 mg，连续10 d，观察力竭性间歇对身体机能的影响。实验结果表明PS的补充能减少积累氧债并能提高运动耐力。

正是基于上述的认识，2006年5月，韩国食品医药品厅(KFDA)允许在添加PS的制品中突出表示，并宣传相关产品有“防止老年人认识力低下”功能。同年10月，美国的食品医药品厅(FDA)通过GRAS(Generally Recognized As Safe，一般认定为安全的物质)认定，PS可作为营养强化型机能性食品素材添加在酸奶，奶粉，面包，粉末饮料等食品中。大量的科学试验已经证实，PS对于神经网络，特别是大脑具有特异性的作用，而那些与年龄相关的认知能力降低(ARCD)和与年龄有关的记忆损伤(AAMI)患者，因为其自身不能合成足够量的磷脂酰丝氨酸，外源性的磷脂酰丝氨酸将会使他们成为最大的受益者。由此可见，随着世界范围内各种疾病的蔓延，健康越来越受到人们的重视，而对人体有重要作用的磷脂酰丝氨酸必将受到人们的广泛关注，高品质PS产品的研发将在食品、药品、保健品方面有很大的应用前景。

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