不同北虫草菌株产类胡萝卜素分析

孙军德，曹婧

(沈阳农业大学土地与环境学院，辽宁沈阳110161)

北虫草又名蛹虫草(Cordyceps militaris(L.)Link)，是一种名贵的药、食两用滋补真菌，极具开发价值。北虫草含有多种生理活性物质，具有抗菌、抗肿瘤、调节机体免疫力等功能［1］。类胡萝卜素是一类黄色、橙红色或红色的天然色素的总称，是一种多烯类化合物。类胡萝卜素能够预防癌症，提高人体免疫力，为人体补充必需的维生素，是一种重要的抗氧化物［2］。现有研究表明类胡萝卜素具有食品着色剂和营养增补剂的双重功效，因而被广泛应用于化妆品、食品、饲料添加剂中。目前对北虫草中虫草素、虫草多糖、虫草酸的研究均较多，尤其对虫草素的研究较为深入［3］，但是对北虫草所产的色素成分类胡萝卜素的研究报道较少。本文通过人工栽培试验获得的子实体，分别测定类胡萝卜素，筛选高产类胡萝卜素的菌株，为北虫草类胡萝卜素在生产中的运用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株K37、B、4号、J、YS2、C菌株采自沈阳棋盘山，保存于沈阳农业大学微生物研究室。

1.1.2 培养基①种子培养基:马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨3 g，MgSO43 g，自来水1 000 mL，pH 7;②栽培培养基:小麦30 g，自来水45 mL。

1.2 方法

1.2.1 子实体栽培在无菌条件下，用打孔器取菌块接入装有100 mL液体培养基的250 mL三角瓶中，23℃振荡培养3 d，4℃冰箱中静置1 d，用营养液稀释后接入栽培培养基中，每瓶接入3 mL。18℃，暗培养5 d，当菌丝覆盖培养基表面后光照转色，21℃培养，进行出草管理，大约50 d左右进行采收［4］，将采收到的子实体在55℃下恒温干燥箱中烘干并研磨成粉末状，待用。

1.2.2 色素的提取称取北虫草子实体粉末各0.05 g，加入0.1 g石英砂，加入10 mL丙酮作为助磨剂，研磨15 min，将研磨后得到的混合液6 000 r/min离心10 min，上清液即为色素提取液。

1.2.3 定性分析①浓硫酸反应:取7支试管，其中6支分别取适量不同菌株的色素提取液溶于10 mL乙醚，然后加入1～2 mL浓硫酸，另1支作为对照组(CK)，静置10 min后，观察溶液颜色变化;②紫外-可见光吸收光谱分析:将色素提取液用U-3010分光光度计(380～600 nm)进行扫描，与标准的类胡萝卜素吸收光谱进行比较。

1.2.4 色素含量分析将提取液稀释8倍后，用U-3010分光光度计(380～600 nm)进行扫描，记录各吸光值。按下式计算色素总量［5-6］:

式中，A:吸光度;V:丙酮用量(mL);D:提取液稀释倍数;E:消光系数(0.16);G:北虫草子实体干重(g)。

2 结果与分析

2.1 北虫草子实体类胡萝卜素的定性分析

2.1.1 类胡萝卜素定性显色结果在北虫草子实体粉末中加入10 mL丙酮作为助磨剂，能破坏细胞壁，有效提高色素的提取率，离心后得到色素提取液。取适量的色素提取液分别加入到试管中，加入10 mL乙醚，再加入1～2 mL浓硫酸，反应10 min后，溶液在两相交界处呈现蓝绿色，对照组溶液没有颜色的变化，见图1。该反应是多烯烃类胡萝卜素特征性反应。

图1 类胡萝卜素定性显色结果Fig.1 Qualitative analysis results of carotenoids color

2.1.2 紫外-可见光吸收光谱分析离心后得到的色素提取液浓度较高，加入70 mL丙酮将色素稀释8倍。用U-3010分光光度计(380～600 nm)进行扫描，见图2。通常类胡萝卜素的紫外-可见光谱为三指状峰状，只有当类胡萝卜素分子中存在共轭状态的碳基时，才会呈单峰状的吸收峰［7］。一般而言，类胡萝卜素的特征吸收峰在380～600 nm范围内［8］。由图2可知，北虫草菌株色素提取液在380～600 nm范围内有3个吸收峰，波长分别为415、440和460 nm，与付鸣佳等［9］报道的416、439和468 nm基本一致。该结果表明北虫草子实体中提取的色素为类胡萝卜素。

图2 北虫草色素的紫外-可见吸收光谱Fig.2 UV-Vis absorption spectrum of Cordyceps militaris pigment

2.2 不同菌株类胡萝卜素含量的比较

通过公式计算各北虫草菌株类胡萝卜素的含量，见图3。由图3可以看出，6个菌株的子实体类胡萝卜素的含量有较大的差异，J菌株子实体中类胡萝卜素的含量最高;其次依次为K37、C、YS2、B菌株;4号菌株子实体中类胡萝卜素的含量最低，与含量最高的J菌株类胡萝卜素的含量相差3.439 mg/g。

图36 个北虫草菌株类胡萝卜素含量Fig.3 The content of carotenoids product of six strains of Cordyceps militaris

3 讨论

本研究对6个北虫草菌株进行人工栽培得到子实体，用研磨法将色素从子实体中提取出来，并通过类胡萝卜素显色反应和紫外-可见光吸收光谱分析对提取的色素进行定性分析，确定北虫草子实体中提取的色素为类胡萝卜素。用分光光度法测定6个菌株子实体类胡萝卜素的含量，不同菌株的类胡萝卜素的含量差异非常显著，其中J菌株的类胡萝卜素的含量明显高于其他菌株。综上所述，J菌株是本研究筛选出的产类胡萝卜素能力较强的北虫草菌株。北虫草中类胡萝卜素的提取研究为北虫草的综合开发提供了一定的参考依据，具有广泛的应用前景。

［1］ 柴建萍，白兴荣，谢道燕，等.蛹虫草多糖的分离纯化及其结构的初步研究［J］.中国生化药物杂志，2003，24(1):23-25.

［2］ 赵文恩，韩雅姗，乔旭光.类胡萝卜素清除活性氧自由基的机理［J］.化学通报，1999，(4):25-27.

［3］ 刘东泽，陈伟，高新华，等.虫草菌素(3'-脱氧腺苷)研究进展(综述)［J］.上海农业学报，2004，20(2):89-93.

［4］ 任国兰，王莉，付贵成，等.北冬虫夏草(Cordyceps militaris)室内栽培技术研究［J］.河南农业大学学报，2006，40(1):67-68.

［5］ Hasegawa J.The Dtermination of Carotene Content in Foods［J］.AgricBiol Chem，1990，(54):1819-1827.

［6］ Rodriguez-Am aya D B.A guide to carotenoid analysis in foods［J］.Washington，D C:ILSI press，2001:14-22.

［7］ 张志军.人工培养蛹虫草(Cordyceps militaris)SY12新型有效成分的研究［D］.中国海洋大学，2007.

［8］ 闫喜涛，包海鹰，图力古尔.人工培养蛹虫草中一种天然色素的分离和结构鉴定［J］.菌物学报，2010，29(5):777-781.

［9］ 付鸣佳，王小菁，黄文芳.蓝光诱导蛹虫草菌丝类胡萝卜素的积累［J］.微生物学通报，2005，32(5):24-28.