BMP4/Smad4在C57BL/6小鼠内耳前庭发育不同阶段的表达△

邓安春 杨仕明 黄德亮 孙建和

哺乳动物内耳前庭末梢感受器包括三个半规管壶腹嵴和两个囊斑，分别感受角加速度和直线加速度，这些功能和精细三维结构是在发育过程中不断形成的。内耳前庭的发育是一个复杂的过程，从胚胎外胚层到听板、听囊，最后发育成熟，既包括外形的初步形成和改建，又包括各种上皮细胞的定向分化等。成年小鼠内耳感觉细胞种类、结构、功能、位置等的多样性决定了其离不开多种影响因素的调控，多种基因在时间、空间上的精细、准确、重叠差异表达，使很少量的相同的胚胎外胚层细胞发育形成结构复杂功能多样的内耳。利用基因敲除、基因打靶等分子生物学技术也证实大约有几十种基因参与形态发育及感觉上皮定向分化的调控，但有关的详细分子机制尚不清楚[1～3]，其中 BMP-Smad途径被认为是最重要的一个。一般认为，BMP-Smad信号转导是细胞定向分化的关键事件之一，各转录因子正是通过调节BMP-Smad信号转导而参与内耳发育的调节[4～6]。但是，BMP-Smad在内耳前庭发育各个阶段的分布、变化有待进一步阐明。为此，本实验选用遗传表型稳定的C57BL近交系小鼠研究前庭发育过程中相关阶段骨形态形成蛋白4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)、Smad4蛋白(drosophila mothers against decapentaplegic protein 4)的表达。

1 材料与方法

1.1实验动物与标本采集 挑选耳廓反应灵敏、健康的2月龄C57BL/6小鼠(北京大学医学部实验动物中心提供)，以雄：雌=1：2的比例作为种鼠，下午5点左右合笼，次日晨8点观察母鼠阴道，若有阴栓，记为胚胎第一天(E1)，动物统一编号，统一饲养。选取从胚胎第10天(E10)到胚胎第20天(E20)每天的孕鼠各两只，动物全部在上午8点处死，E10～E17时颞骨未钙化，难以从头颅中摘取内耳，故留取胚胎头，E18～E20时颞骨钙化，胚胎头中的颞骨脱钙困难，导致切片困难，故留取胚胎内耳。动物的使用获得中国人民解放军总医院动物伦理委员会的授权。

1.2主要方法与试剂

1.2.1冰冻切片 将留取的胚胎小鼠头或胚胎小鼠内耳固定(4%多聚甲醛+2.5%戊二醛，4℃冰箱过夜)、脱钙(10%EDTA，4℃冰箱48小时)、脱水(20%蔗糖溶液，过夜)、浸透及包埋(OCT液，过夜)，在包埋管中定位后于液氮液面冷气急冻40秒，取出粘托，然后切片：胚胎头平行于口-耳平面切片，内耳平行于蜗轴切片，均连续切片，片厚6 μm。镜下看到壶腹嵴和囊斑时，间断取片，-70℃冰箱保存备用。

1.2.2免疫组化染色及免疫荧光检测 兔来源Smad4抗体和羊来源的BMP4抗体均购自美国Santa Cruz生物技术公司。免疫组化按照试剂盒说明书操作，大致步骤包括：冰冻切片放至室温、60℃烤箱烤片半小时后用蒸馏水洗去OCT、高压抗原修复3分钟、3%H2O2室温孵育10分钟消除内源性过氧化物酶活性、滴加封闭血清室温孵育15分钟、滴加一抗(1:100 PBS稀释)4oC冰箱过夜、滴加生物素标记二抗37℃孵箱40分钟、滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液室温孵育15分钟、DAB显色、苏木素复染、脱水、透明、封片后光镜下观察并采集图像，分析各抗体表达的部位及强弱。

免疫荧光染色按照试剂盒说明书操作，大致步骤与免疫组化染色相同，只是二抗是荧光标记抗体(1:50 PBS稀释)， 37℃孵箱1小时后防淬灭封片剂封片，然后在荧光显微镜下观察并采集图像。羊抗兔Alexa fluor 488荧光标记二抗购自美国Molecular probes公司，SP-9003免疫组化检测试剂盒购自北京中杉金桥生物工程技术有限公司，DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物工程技术有限公司。

1.2.3免疫组化及免疫荧光结果判定 在40倍的物镜下对发育过程中前庭部分的全部区域进行观察，DAB染色阳性为棕色，荧光染色阳性为绿色荧光。记录染色阳性的细胞数和染色的强度。以阳性细胞占观察区域内前庭部分全部细胞的比例分为5级计分：0为<5%；1为5%～25%；2为26%～50%；3为51%～75%；4为>75%。染色的阳性强度按三级计分：1+为弱阳性；2+为中度阳性；3+为强阳性。每例染色的阳性细胞比例与染色强度相乘作为染色的加权计分值，该值>1为阳性，<1为阴性。

2 结果

2.1BMP4在小鼠内耳前庭发育不同阶段的表达 从E10开始，小鼠内耳听囊就有BMP4的阳性表达。E10和E11小鼠听囊的上皮细胞里有较强的BMP4表达；E12时耳周间充质开始浓聚，听囊变长且可分为明显的前庭囊和耳蜗囊两部分，BMP4主要表达在前庭囊以及前庭囊周围浓聚的耳周间充质，这些浓聚的间充质将形成耳软骨囊；E13时内耳进一步发育，BMP4在所有已出现的半规管、半规管壶腹、壶腹嵴、囊及囊斑里均有阳性表达，在软骨囊的表达逐渐局限于半规管的背侧及外侧，中部前庭结构的外侧耳周间充质；此后BMP4在小鼠内耳的表达越来越强，E14时与E13的表达类似，不过在软骨囊里的表达范围较E13时扩大，而且此时在耳蜗囊周围的软骨囊里也有BMP4的局部表达；到E15时基本与出生后的表达情况相当，不再发生变化，软骨囊里BMP4的表达基本勾画出内耳的大致形态。在感觉斑里，BMP4主要表达在感觉斑毛细胞的胞浆中，集中在靠囊腔的一侧，胞核及支持细胞里也有BMP4阳性表达(图1)。

2.2Smad4在小鼠内耳前庭发育不同阶段的表达 从E10到E12，小鼠内耳没有Smad4的表达；E13小鼠内耳在椭圆囊始基和半规管及半规管壶腹嵴始基的上皮细胞里有非常弱的Samd4表达，E14时比E13的表达略为增强；E15时各个壶腹嵴、囊斑里均有明显的较强的Smad4表达，此时的表达主要局限在各感觉斑的上皮细胞里，而内耳周围的软骨囊此时还没有Smad4的表达；到E16时，各感觉斑和软骨囊里的Smad4表达与E19时相同，均为强阳性。感觉斑里的毛细胞、支持细胞均有Smad4表达，主要表达在毛细胞的胞浆中，核内较少，而支持细胞主要表达在胞核(图2)。

3 讨论

BMPs是TGF-β超家族的重要成员，在早期胚胎发育和器官形成的多个方面均有着多种不同的生物学活性[4]，其中BMP4与软骨或骨发育的关系早已明确[5～8]，而且BMP4也影响内耳形态的形成[6，9，10]，本实验结果与此一致，支持BMP4参与内耳形态形成的观点。但是，BMP4在内耳前庭发育的哪个阶段开始起作用的，目前不清楚。

内耳骨迷路是软骨化骨而来，而内耳软骨是耳周浓聚的间充质转化而来。本研究发现，耳周间充质开始浓聚时就有BMP4的表达，具备了其参与耳周软骨囊形成的条件，也就是说，在内耳前庭骨迷路发育刚被启动时BMP4就可能开始起作用了。但BMP4并不是从一开始就包绕整个内耳，而是从局部表达开始，再逐步扩大，从文中结果看，开始主要位于半规管始基周围，而且其在耳蜗囊周围出现的时间明显晚于其在前庭囊周围出现的时间，这个过程可能正是耳周间充质向软骨转化的过程。正是由于这个过程的存在，各处软骨囊形成的时间先后不一，需要BMP4的时间也先后不一，当BMP4基因剔出后，需要BMP4较晚的部位可能会激活其它的替代信号途径，造成对小鼠内耳不同部位产生不同的影响[6，11]。

内耳膜迷路的发育起源于听板，文献报道BMP4早在听板时期就有表达，对听板的发育有影响[12，13]。本研究从听板内陷形成听凹继而闭口形成听囊后开始，结果提示BMP4的表达从E10开始直到成年，贯穿了小鼠内耳发育的整个过程，在内耳膜迷路有广泛分布。其在E10听囊上皮里的充分表达早于间充质浓聚的时间，说明其对膜迷路发育的作用与对骨迷路发育的作用是相对独立的，不仅仅与内耳骨形态的形成有关，而且对膜迷路的形态形成可能也具有非常重要的作用。事实上，膜迷路大体形态基本形成以后，其周围的软骨囊才逐渐形成，也提示对软骨囊发育的影响只能部分影响到内耳膜迷路的形态。

BMP4对内耳感觉上皮分化发育的作用目前没有统一的意见，有些研究支持其参与毛细胞分化发育，有些研究却与此相反[6，9，14～16]。本实验结果及文献[17]提示其在各感觉斑上皮细胞里均有表达，推测其参与了毛细胞的分化发育是合理的。其主要表达在毛细胞内，支持细胞内也有表达，提示其除了通过旁分泌作用影响上皮与上皮周围中胚层组织之间的作用，参与内耳形态的发育之外，可能还参与了毛细胞、支持细胞的增殖及毛细胞的分化过程。其在毛细胞中主要位于胞浆靠腔面侧，可能与其需要分泌到细胞外与胞膜上的受体作用后方可起作用有关。

图1 BMP4在小鼠内耳前庭发育不同阶段的表达从E10(a)开始，小鼠内耳就有BMP4的表达。E10(a)和E11(b)小鼠听囊的上皮细胞里有较强的BMP4表达；E12(c、d)时听囊变长且可分为明显的前庭囊(VN)和耳蜗囊(CN)两部分，BMP4主要表达在前庭囊以及前庭囊周围浓聚的耳周间充质；E13时BMP4在所有已出现的半规管、半规管壶腹、壶腹嵴(f)、囊及囊斑(e)里均有阳性表达；到E15时(g～l)基本与出生后(m、n)的表达情况相当，不再发生变化，软骨囊里BMP4的表达基本勾画出内耳的大致形态。在感觉斑里，BMP4主要表达在感觉斑毛细胞的胞浆中，集中在靠囊腔的一侧，胞核及支持细胞里也有BMP4阳性表达。标尺均为50 μm

图2 Smad4在小鼠内耳发育不同阶段的表达E10～E12 Smad4表达阴性(a、b、c)；E13小鼠内耳椭圆囊始基(d)和半规管及半规管壶腹嵴始基(e)的上皮细胞里有非常弱的Samd4表达； E15各个壶腹嵴(h)、囊斑(f、g)里均有较强的Smad4表达，主要局限在各感觉斑的上皮细胞里，但内耳周围的软骨囊(i)Smad4表达阴性；E16时各感觉斑(j、k)和软骨囊(l)里Smad4表达与E19(m、n、o)时相同，均为阳性。表达在毛细胞的胞浆中，核内较少，而支持细胞主要表达在胞核。标尺为50 μm

Smads蛋白是BMP4受体复合物的下游信号调节蛋白，可将信号从细胞膜直接转导至细胞核，从而对BMP4胞内信号转导起着关键的作用。其中，Smad4作为BMP4信号传导通路中的通用Smad，在细胞增殖、分化、移行、凋亡等过程中可能起着尤其重要的作用，从而参与内耳形成与感觉上皮分化的调控。理论上说，有BMP4出现的时间、区域就会有Smad4的存在。但是，本实验发现从E10到E12，小鼠内耳没有Smad4的表达，E13、E14也只有很弱的表达，这个发育阶段里的BMP4只能通过非Smad信号途径转导，而且耳周软骨囊里直到E16才有明显的Smad4表达，此时BMP4在耳周软骨囊里已基本将内耳轮廓勾画出来。Smad4相对于BMP4的这种滞后表达的意义目前尚不清楚，有研究者推测Smad4在BMP信号转导途径中不一定具有中心地位[11，18]，也许BMP-Smad信号转导途径与轮廓早期形成的关系不大而是与其稍晚的外形修饰及功能发育有关。研究发现Smad4剔除后内耳轮廓基本完整但局部发生明显畸形似乎支持这一推论[19]。

E13开始小鼠内耳有Samd4表达但很微弱，到E15时表达才比较明显，且主要局限在壶腹嵴、囊斑，这与本实验发现感觉斑里Myosin阳性毛细胞出现的时间一致(为本实验的其他数据，即将在第三军医大学学报发表)，提示这二者间可能有某种联系，可能BMP-Smad信号途径在毛细胞的分化成熟中具有重要作用。Smad4基因剔除纯合子(Smad4-/-)小鼠在胚胎发育早期死亡，Smad4基因剔除杂合子小鼠(Smad4+/-)与野生型小鼠(Smad4+/+)相比，其听力明显下降，内耳毛细胞严重缺失[20～22]，似乎证明了这一点。

总之，本研究可以肯定BMP4、Smad4在内耳前庭发育中客观存在，但BMP-Smad信号途径在其中的作用并不明了。BMP4参与了内耳前庭形态的形成及感觉上皮的分化发育，而Smad4可能主要参与了发育后期的形态塑形和功能发育。

4 参考文献

1 Anagnostopoulos AV. A compendium of mouse knockouts with inner ear defects[J]. Trends Genet, 2002, 18:499.

2 Chatterjee S, Kraus P, Lufkin T. A symphony of inner ear developmental control genes[J]. BMC Genet， 2010,11:68.

3 Fritzsch B, Beisel KW, Hansen LA. The molecular basis of neurosensory cell formation in ear development: a blueprint for hair cell and sensory neuron regeneration[J]? Bioessays, 2006,28:1 181.

4 Lan HY, Chung AC. Transforming growth factor-β and Smads[J]. Contrib Nephrol, 2011,170:75.

5 Ohta S, Mansour SL, Schoenwolf GC. BMP/SMAD signaling regulates the cell behaviors that drive the initial dorsal-specific regional morphogenesis of the otocyst[J]. Dev Biol 2010,347:369.

6 Blauwkamp MN, Beyer LA, Kabara L, et al. The role of bone morphogenetic protein 4 in inner ear development and function[J]. Hear Res, 2007,225:71.

7 Tsumaki N, Yoshikawa H. The role of bone morphogenetic proteins in endochondral bone formation[J]. Cytokine Growth Factor Rev, 2005,16:279.

8 Cao X, Chen D. The BMP signaling and in vivo bone formation[J]. Gene, 2005,357:1.

9 Li H, Corrales CE, Wang Z, et al. BMP4 signaling is involved in the generation of inner ear sensory epithelia[J]. BMC Dev Biol, 2005,5:16.

10 Liu W, Oh SH, Kang Yk Y, et al. Bone morphogenetic protein 4 (BMP4): a regulator of capsule chondrogenesis in the developing mouse inner ear[J]. Dev Dyn, 2003,226:427.

11 唐静,戴立里,呙琳琳,等. 肝纤维化中丹参素对TGFβ_1/Smads/ERK信号通路的影响及其相互关系[J].第三军医大学学报,2011,33:1 159.

12 Beisel KW, Wang-Lundberg Y, Maklad A, et al. Development and evolution of the vestibular sensory apparatus of the mammalian ear[J]. J Vestib Res, 2005, 15:225.

13 Brown ST, Martin K, Groves AK. Molecular basis of inner ear induction[J]. Curr Top Dev Biol, 2003, 57:115.

14 Chang W, Nunes FD, De Jesus-Escobar JM, et al. Ectopic noggin blocks sensory and nonsensory organ morphogenesis in the chicken inner ear[J]. Dev Biol, 1999,216:369.

15 Chang W, ten Dijke P, Wu DK. BMP pathways are involved in otic capsule formation and epithelial-mesenchymal signaling in the developing chicken inner ear[J]. Dev Biol, 2002,251:380.

16 Fekete DM, Wu DK. Revisiting cell fate specification in the inner ear[J]. Curr Opin Neurobiol, 2002,12:35.

17 Oh SH, Johnson R, Wu DK. Differential expression of bone morphogenetic proteins in the developing vestibular and auditory sensory organs[J]. J Neurosci, 1996,16:6 463.

18 Chu GC, Dunn NR, Anderson DC, et al. Differential requirements for Smad4 in TGF beta-dependent patterning of the early mouse embryo[J]. Development， 2004，131:3501.

19 Yang SM, Hou ZH, Yang G, et al. Chondrocyte-specific Smad4 gene conditional knockout results in hearing loss and inner ear malformation in mice[J]. Dev Dyn, 2009,238:1 897.

20 胡吟燕，杨仕明，卢云，等. Smad4 基因缺陷小鼠耳形态学改变的初步研究[J]. 中华耳科学杂志, 2006,4:172.

21 侯昭晖，杨仕明，郭维，等. Smad4 条件基因敲除小鼠听功能初步研究[J]. 中华耳科学杂志, 2006,4:176.

22 卢云云,杨仕明,郭维维,等. Smad4基因敲除对小鼠听力和前庭功能的影响[J]. 听力学及言语疾病杂志,2005,13:424.